Membránová technologie a čiření vakcíny (Ⅰ)
Vakcíny pocházejí z různých zdrojů, včetně tkáňových extraktů, bakteriálních buněk, virových částic, proteinů a nukleových kyselin produkovaných savčími rekombinantními buňkami, kvasinkami a hmyzími buňkami.
Nejběžnější způsob výroby vakcíny je založen na procesu počáteční fermentace, po kterém následuje purifikace. Výroba vakcíny je složitý proces, který zahrnuje mnoho různých kroků a procesů. Výběr správného způsobu čištění je rozhodující pro dosažení požadované čistoty konečného produktu. Čištění vakcín je důležitým krokem, který má významný dopad na výtěžnost produktu a následné následné čištění. K vyjasnění vakcín lze použít několik technik. Výběr metody sběru a zařízení závisí na typu baterie, povaze shromažďovaného produktu a procesní kapalině. Mezi tyto techniky patří membránová filtrace (mikrofiltrace, filtrace s tangenciálním tokem), centrifugace a hloubková filtrace (filtrace s normálním průtokem). Z dlouhodobých zkušeností vyplývá, že čiření sklizně vakcíny se obvykle dosahuje centrifugací následovanou hlubokou filtrací.
V posledních letech se při objasňování vakcín do popředí dostaly techniky založené na membránách. Upstream procesy stále více využívají jednorázové technologie, takže strategie sklizně se musí změnit. Tento článek poskytuje komplexní přehled různých membránových technologií a jejich aplikací při objasňování vakcín.
01 Úvod
Vakcíny jsou kritickou součástí naší prevence infekčních nemocí, které zůstávají šokující příčinou úmrtí. Před záškrtem, tetanem, černým kašlem a spalničkami se každý rok díky imunizaci zachrání 2 až 3 miliony lidí. Vakcíny pokrývají širokou škálu, od malých rekombinantních proteinů až po celé virové částice a celé bakterie. Mohou být produkovány různými systémy: vejci, savčími buňkami, bakteriemi atd. Kvůli složitosti a rozmanitosti vakcín v současnosti neexistuje žádný hlavní proud purifikačního protokolu nebo šablony, a to navzdory rostoucímu zájmu o očkovací platformy.
Typicky lze vakcinační proces rozdělit do tří částí: upstream (výroba a čiření), následná úprava (čištění včetně ultrafiltrace, chromatografie a chemické úpravy) a formulace (konečné plnění). Nezávisle na výrobním systému hraje čiření (počáteční odstranění nežádoucích látek) klíčovou roli při určování robustního procesu čištění. Správný krok čištění odstraňuje hlavně celé buňky, buněčné zbytky, koloidy a velké agregáty, aby se snížila zátěž následného zpracování. V některých případech může čiření také snížit nerozpustné nečistoty, proteiny hostitelské buňky (HCP) a nukleové kyseliny hostitelské buňky. Jako každý jiný purifikační krok, i krok čeření musí být optimalizován, aby se dosáhlo maximálního výtěžku produktu a čistoty a zároveň se přizpůsobil specifičnosti a výrobním omezením vakcíny.
Vzhledem k heterogenitě typů vakcín se pro čiření používá celá řada technik, včetně centrifugace nebo filtrace (tabulka 1).
K dosažení požadovaného vyjasnění je obvykle zapotřebí několik sérií operací. První operace je určena k odstranění větších částic (primární čiření) a druhá operace je určena k odstranění koloidů a dalších submikronových částic (sekundární čiření). Nízkorychlostní centrifugace slouží jako jednorázová možnost čištění, která umožňuje odstranění buněk a buněčného odpadu precipitací. Centrifugace dokáže zvládnout vysoké zatížení pevných látek a byla široce používána v dávkových nebo kontinuálních režimech a diskových odstředivkách. Vyžaduje vysoké kapitálové investice a náklady na údržbu a čelí problémům při zvětšování kvůli nedostatku spolehlivého zmenšeného modelu. Někteří komerční výrobci vakcín však používají centrifugy ve velkovýrobě zahrnující vysoké objemy zpracování a více výrobních činností.
Čiřící filtraci lze provádět filtrací s normálním průtokem (NFF, také známá jako filtrace se slepým koncem) nebo filtrací s tangenciálním tokem (TFF, také známá jako filtrace s křížovým tokem). Existují také specifické režimy filtrů (hluboké filtry), které obsahují kladně nabité materiály a filtrační pomůcky, které zvyšují zadržování buněčných úlomků, koloidů a negativně nabitých nežádoucích složek.
Membránové filtry zadržují částice vyloučením velikosti a nemají vysokou kapacitu zadržování nečistot, takže jsou vhodné pro sekundární čištění. Jak hloubkové filtry, tak membránové filtry lze snadno škálovat a implementovat (jednoduchý návrh systému). Na rozdíl od NFF se TFF používá hlavně pro primární čiření (mikrofiltraci). Membrány s mezním rozsahem 0.1-0,65 μm (nejlépe s otevřeným kanálem) byly úspěšně použity k zadržení buněk, buněčných zbytků a dalších velkých kontaminantů. Většina zařízení TFF je lineárně škálovatelná a po vyčištění znovu použitelná, což výrazně snižuje náklady na spotřební materiál pro daný krok.
Krok čeření leží mezi upstream a downstream procesy a je někdy během vývoje vakcínového procesu přehlížen, protože čas a zdroje jsou upřednostňovány pro jiné purifikační kroky, jako je chromatografie nebo centrifugace s hustotním gradientem.
Dokonce i patenty na procesy výroby vakcín často opomíjejí krok objasnění. Účinnost čištění přímo ovlivňuje výkon následného procesu. Špatně optimalizovaný krok čiření může negativně ovlivnit kapacitu sterilizovaného filtru nebo může zkrátit životnost chromatografické pryskyřice. Dnes přísnější regulační očekávání nutí výrobce vakcín vyrábět čistší, dobře charakterizované, ale cenově dostupné vakcíny. V tomto případě je potřeba každému kroku věnovat pozornost, kterou si zaslouží. Současné trendy naznačují, že upstream proces směřuje k „čistějšímu“ expresnímu systému (tj. buňky kultivované v médiu bez séra nahrazují vajíčka) se zvýšenou produktivitou a vyšší hustotou buněk.
Procesy následného čištění se zjednodušují a zefektivňují, aby se zvýšila čistota konečného produktu. Pro zvládnutí těchto změn se krok vyjasnění nemůže stát úzkým hrdlem. V tomto případě se filtrační technologie setkává s novou výzvou k objasnění, řeší problémy zvýšené flexibility procesu, možnosti jednorázového použití a snížení investičních nákladů.
02 Objasnění virových vakcín
Několik typů čiřicích metod, buď samostatně, nebo v kombinaci, bylo úspěšně použito k čiření sklizně na konci krmení vakcín.
Pilotní měřítko:1-20L, výrobní měřítko: více než 20L
2.1 Opatření pro objasnění virové vakcíny
Mnoho vakcín obsahuje všechny nebo část virových částic k vytvoření imunity proti virové infekci. Obecně spadají do čtyř širokých kategorií:
Živá atenuovaná vakcína (LAV), která je založena na oslabeném kmeni viru, aby se snížila jeho virulence. Oslabené viry se mohou v těle replikovat, ale nejsou patogenní.
- Inaktivované virové (IV) vakcíny, které obsahují chemicky nebo ultrafialově inaktivované viry k odstranění infekčnosti. Virové částice mohou být kompletní, rozdělené nebo purifikované (pouze antigenní proteiny).
- Vakcína virového vektoru (VV) je aktivní, nepatogenní virus, který představuje antigen patogenního viru. Tyto nedávno vyvinuté struktury se také používají pro aplikace genové terapie.
Vakcíny s virovými částicemi (VLP), specifická třída virových podjednotkových vakcín, které napodobují celkovou strukturu virových částic, ale neobsahují infekční genetický materiál.
Ve většině případů jsou virové částice během kroku čeření zcela intaktní, dokonce i během lýzy virové vakcíny (štěpení se obvykle provádí po proudu, ve více čištěném prostředí).
Hlavním úkolem virového objasnění je získání virových částic s vysokým výtěžkem při účinném odstraňování buněčných zbytků, velkých agregátů a nerozpustných kontaminantů. Jak je popsáno v následujících částech, existuje několik faktorů, které mohou způsobit degradaci nebo ztrátu viru. Navíc může být obtížné spoléhat se na virový výtěžek kvůli vysoké variabilitě virových kvantitativních testovacích metod v této fázi procesu, zejména u LAV a VV vakcín. U těchto vakcín je výtěžek viru často hodnocen pomocí testů infekčnosti, jako je test plaků nebo test TCID50. Skutečnost, že některé ze získaných sloučenin mohou interferovat se schopností viru infikovat indikační buňky, zvyšuje variabilitu tohoto kvantitativního přístupu.
2.2 Strategie vyjasnění virové vakcíny
Virové vakcíny se velmi liší ve velikosti, struktuře, tvaru a expresních systémech (tabulka 3).
V důsledku toho obecně neexistuje žádná šablona pro jeho následné procesy, zejména kroky vyjasnění. Teoreticky mohou být vybrány a potenciálně kombinovány všechny dostupné techniky (nízkorychlostní centrifugace, mikrofiltrace TFF, NFF) k objasnění viru. Ve skutečnosti je úspěch čiřicích metod ovlivněn expresním systémem a fyzikálně-chemickými vlastnostmi příslušných virů.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} buněk /ml) metoda čeření využívající kationtové polymery zmenšila oblast hluboké filtrace 4krát ve srovnání s tradičními metodami. Tato technika umožňuje sklizeň velkokapacitních fermentorů bez použití odstředivek. Podobně Riske a kol. ukázaly, že ošetření chitosanem na 40 1 buněčných kulturách (0,02 %) obsahujících 1.4-2,6 % pevných látek vedlo k 7-násobnému zvýšení absolutní filtrační kapacity po hluboké filtraci.
Zmiňují také, že se zdá, že chitosan zlepšuje účinnost čištění flokulací submikronových částic, které se obvykle usazují v odstředivkách. Metody předběžného ošetření a flokulace budou pravděpodobně i nadále součástí budoucích objasnění filtrace vakcín. Penetranty, včetně cukrů, glykolů a aminokyselin, přednostně flokulují viry. Virovou flokulaci osmotickým roztokem následovanou 0.2µ mikrofiltrací lze použít jako komplexní proces pro purifikaci viru. Penetranty mohou stimulovat agregaci virů snížením hydratační vrstvy kolem částic, aby flokulovaly hydrofobní nezapouzdřené virové částice a zapouzdřené virové částice. Ačkoli bylo prokázáno, že penetranty flokulují viry, metoda má potenciál být platformou pro budoucí purifikaci vakcín a její proveditelnost v pilotním nebo velkém měřítku vakcínové purifikace nebyla prokázána. Metoda předúpravy flokulací, která bude pravděpodobně i nadále součástí budoucího čištění filtru vakcíny, se provádí ve 21 fermentoru. Aby mohly být potenciálně použity ve velkých výrobních operacích, musí být tyto metody ověřeny v pilotním a výrobním měřítku.
2.2.1 Vyjádření dopadu systému
Způsob čiření závisí hlavně na typu procesu a expresního systému, který určuje typ a úroveň kontaminantů, které mají být odstraněny. Virové vakcíny jsou obvykle produkovány v kuřecích embryích kontinuálními buněčnými liniemi savců nebo ptáků nebo bakulovirovými/hmyzími buňkami, které jsou složitějším expresním systémem. Některé typy VLP mohou být také produkovány jinými heterologními expresními systémy (bakterie, kvasinky, rostlinné buňky).
2.2.1.1 Virus produkovaný kuřecím embryem
Vakcíny se vyrábí ve vejcích po celá desetiletí. Tato práce se datuje do roku 1931, kdy Woodruff a Good Pasture úspěšně použili chorio-alantoidní membránu plodných vajíček jako substrát pro růst virů. Dnes se pomocí tohoto starověkého procesu stále vyrábí mnoho lidských a veterinárních vakcín. Nejznámější je asi vakcína proti sezónní chřipce. Principem je naočkování slepičích vajec zájmovými viry a poté replikace v chorio-alantoidní membráně. Po rozmnožování se shromažďuje a čistí alantoická tekutina bohatá na virové částice.
Alantoická tekutina je náročným čiřicím krmivem. Jeho vysoký obsah minerálů a bílkovin (včetně ovalbuminu) mu dodává vysokou viskozitu. Alantoická tekutina také obsahuje základní tkáňové sloučeniny z kuřecích embryí, jako jsou peří, zobáky, krevní cévy nebo krevní buňky. Vzhledem k vysokému obsahu pevných látek je preferovanou možností primárního čištění nízkorychlostní odstřeďování, které obvykle vede k výtěžnosti přibližně 70 %. Je však také možné primární čiření pomocí filtračních technik. Pro NFF mají hloubkové filtry na bázi polypropylenu a celulózy dobré schopnosti shromažďovat alantoické tekutiny. Povrchové filtry vyrobené z polypropylenu nebo hloubkových filtrů na bázi celulózy mohou mít kapacitu 150-210 l/m² a snížit zákal vstupního proudu až 3krát. Zařízení TFF s otevřeným přívodním kanálem je také vhodné pro čiření alantoické tekutiny, protože zařízení je vhodnější pro minimální tlakovou ztrátu přívodním kanálem, čímž se snižuje zablokování kanálu.
Krok sekundárního vyčeření lze snadno provést pomocí NFF. Kombinace materiálů z polypropylenu, celulózy a skleněných vláken obecně vykazuje dobrou účinnost a alternativou k sekundárnímu kroku čištění je použití TFF a {{0}},65μm nebo 0,45μm mikrofiltrační membránové zařízení a provozování osmotického toku řízení. V tomto kroku lze použít zařízení TFF s otevřeným kanálem s hydrofilní PVDF nebo hydrofilní PES membránou.
Je důležité poznamenat, že virové částice mohou být spojeny s nerozpustným odpadním materiálem, což může významně snížit produkci viru během čiření. Použití solného roztoku může snížit toto spojení mezi viry chřipky a pevnými fragmenty, což vede ke zhruba dvojnásobnému zvýšení produkce bez ovlivnění integrity virových částic.
2.2.1.2 Viry produkované v po sobě jdoucích savčích a ptačích buněčných liniích
V poslední době se některé virové vakcíny odklonily od procesů založených na vejcích ve prospěch procesů založených na buněčných kulturách (zejména u vakcín proti chřipce). Hlavním důvodem tohoto přechodu je zabránění problémům s produkcí vakcíny spojenými s embryonálními vejci (tj. nedostatek zásob vajec, ke kterému může dojít v případě propuknutí jakékoli choroby drůbeže). V důsledku toho je v současnosti vyvíjeno mnoho typů vakcín a virových vektorů s použitím kontinuálních buněčných linií od savců nebo ptáků, konvenčních buněčných linií (jako jsou buněčné linie Vero, MDCK nebo HEK293) nebo proprietárních buněčných linií.
V závislosti na expresním systému může virus zůstat uvnitř buňky, což vyžaduje krok buněčné lýzy, nebo může zůstat mimo buňku (lýza nebo pučení). Pevná náplň a rozpustný obsah získané z buněčné kultury jsou mnohem čistší než alantoická kapalná fáze. Díky tomu je technologie NFF snadněji implementovatelná a kapacita je výrazně vyšší. Filtrační kapacita je však vysoce závislá na podmínkách buněčné kultury, jako je hustota buněk nebo životaschopnost buněk při sklizni. Tyto parametry ovlivňují množství buněčných zbytků a makroagregátů, které mohou ucpat hluboké filtry a membrány, což má za následek snížení kapacity.
Thomassen a kol. poskytují dobrý příklad objasnění NFF. Používá se v procesu výroby inaktivovaného polioviru (IPV). Vero buňky kultivované na mikronosičích byly použity pro virovou proliferaci s hustotou buněk {{0}},78 x 106 buněk/ml TOI. 75μm nerezové síto se používá pro předčištění k odstranění mikronosičů ze sklizně. Dvouvrstvé třídění se vyčeří pomocí hustotního hlubokého filtru (0.2-2,0μm) a následně sterilizovaného jakostního filtru.
Vybraná škálovatelná jednorázová jednotka byla úspěšně použita pro přípravu materiálu pro klinické hodnocení Sabin IPV v měřítku 350 l. V závislosti na sérotypu viru se získá míra obnovy viru 86 až 96 procent.
2.2.1.3 Bakulovirové/viru podobné částice produkované v systému hmyzích buněk
Úvaha o bakulovirových/hmyzích buněčných systémech pro produkci vakcín ve velkém měřítku je relativně nová, ale přitahuje rostoucí zájem v oblasti virových vektorů a VLP. Hlavní výhodou tohoto systému je, že zahrnuje krátkodobou (není potřeba zakládat buněčné linie) a bezpečnou (žádná kompletní virová DNA) produkci. Existují také některé nevýhody, jako je potřeba odstranění bakuloviru a stabilita produktu.
Cervarix, vakcína VLP proti infekci lidským papilomavirem produkovaná společností GlaxoSmithKline, je první lidskou vakcínou, která se komerčně vyrábí v hmyzích buňkách. V současné době se vyvíjí řada vakcín založených na VLP a rAAV vektorech produkovaných v buňkách hmyzu infikovaných bakulovirem. Hmyzí buněčné linie odvozené z podzimního háďátka Spodoptera frugiperda (Sf9 a Sf21) a ohýbačky zelné Trichoplusia ni (buňky BTI-TN5B1-4) jsou nejčastěji používané kvůli jejich schopnosti růst v suspenzi, což zjednodušuje amplifikaci upstreamu. proces. Po růstu na požadovanou hustotu živých buněk jsou tyto buňky infikovány rekombinantním bakulovirem ve fázi exponenciálního růstu buněk pro expresi proteinu. Velký genom bakulovirů umožňuje expresi pěti nebo více různých proteinů, což odpovídá složitosti VLP a virových vektorů.
Bernard a kol. popsal následný proces buněčné kultury hmyzu. Proces je vysoce variabilní, což odráží rozmanitost proteinů produkovaných touto technikou. První krok purifikační sekvence je silně ovlivněn objemovými charakteristikami bioreaktoru (tj. hustotou a životaschopností buněk) nebo povahou uvolňování produktu (vylučovaného pučením nebo lýzou buněk). Bakulovirová infekce hmyzích buněk může způsobit rozpad buněk během 3-5 dnů. Destrukce buněk může vést ke zvýšení proteolytické aktivity a dalších faktorů prostředí, které mohou vést k degradaci rekombinantních proteinů.
Byly pokusy vyvinout bakuloviry s nižší schopností iniciovat buněčnou lýzu. Bakulovirus lyžuje méně než 10 procent infikovaného hmyzu.
Buněčná lýza může být provedena pomocí různých metod, jako je zmrazování-rozmrazování, detergenty, homogenizátory nebo ošetření ultrazvukem. Buňky hmyzu nemají buněčnou stěnu, a proto se rychle rozpouštějí. Ačkoli ultrazvukové ošetření bylo popsáno v mnoha procesech na stolici, zřídka se používá v experimentálním nebo komerčním měřítku. Nejběžnější metodou je použití homogenizátoru ke zničení buněk v přítomnosti detergentu s nízkou koncentrací (0.1% Triton X-100 nebo NP-40). Použití detergentů a mikrofluidizace nebo osmotické nárazové homogenizace byly úspěšně použity v mnoha výrobních procesech ve velkém měřítku. Typicky jsou hmyzí buňky suspendovány v lyzačních pufrech (50mM TRIS pH7,7, 300mM NaCl, 5% glycerol, 0,2mM PMSF a inhibitory proteázy), během kterých Triton-X100 se přidá do konečné koncentrace 0,1 %, následuje mírný ultrazvuk nebo mikrofluidizace. Směs se poté odstředí, aby se odstranily nerozpustné částice.
V této fázi se lyzát může jevit jako velmi zakalený a je obtížné jej filtrovat pomocí 0.45μm filtru. Někdy lze pozorovat ztráty až 30 % během kroku čištění pyrolýzou. Přídavek benzoenzymů ve fázi štěpení pomáhá vyřešit problém filtrace. Čištění buněk fosfátem pufrovaným solným roztokem po sklizni a rychlé "zmrazení-rozmrazení" ve vysokém obsahu soli (500 mM NaCl) obsahující krakovací pufr pomáhá odstranit agregáty.
Čištění VLP a virových vektorů produkovaných hmyzími buňkami nastává po buněčné lýze (chemickým nebo mechanickým ošetřením), která uvolňuje nejen virové částice, ale také velké množství buněčné nukleové kyseliny. Hmyzí buňky jsou schopny růst při vysoké hustotě buněk, od 1-9.10 6 buněk/ml. Krok vyčeření by se proto měl zabývat vysokou hustotou buněk, vysokým obsahem nukleových kyselin a, pokud je to možné, odstraněním bakulovirových částic. Aby to bylo složitější, VLP nebo virové vektory a bakuloviry mohou mít podobné velikosti (bakuloviry jsou 60-80 nanometrů široké a 300-400 nanometrů dlouhé). Vzhledem k vysoké hustotě buněk byla po desetiletí preferovanou technikou primárního čištění centrifugace. Membránové procesy se však zdají být velmi atraktivní alternativou, protože škálovatelnost lze snadno definovat.
Hluboké filtry byly účinně použity v následném procesu třívrstvých částic podobných rotavirům. Na laboratorní úrovni se k čištění těchto komplexních částic často používá metoda ultracentrifugace s hustotním gradientem CsCl. Výzkumníci hodnotili nejen krok čiření hlubokého filtru, ale také celý následný proces (štěpení Triton X-100 a hloubková filtrace, následovaná ultrafiltrací a vyloučením velikosti částic). Výsledky ukazují, že výtěžek hustotního gradientu CsCl může dosáhnout 37 %.
Ultraodstředivá metoda je asi 10%. Jako další příklad byla použita dutá vlákna 0,45 um a vlákna o jemném průměru 500 kDa k získání a koncentraci částic podobných HIV produkovaných v hmyzích buňkách. V této studii byla smyková síla dutých vláken optimalizována na základě buněčné integrity. Výsledky Byl zaveden proces s nízkou smykovou silou, který nahradil ultracentrifugaci v gradientu stolního cukru.
Proces má potenciál být aplikován na hromadnou výrobu. Hluboké filtry byly také úspěšně použity při produkci rekombinantních adeno-asociovaných virů. Buněčná lýza byla provedena dvoupístovým mechanickým rušičem buněk, po kterém následovalo ošetření nukleázou. V kroku čeření byl použit 1,2μm hloubkový filtrační prvek ze skleněných vláken, následovaný dvěma vrstvami 0,8μm hydrofilního PES a 0,2μm hydrofilního PES. Proporcionálně velké filtry se používají pro procesní dávky od menších do velikostí 200 L. Hluboké filtry byly úspěšně použity a hodnocení TFF s plochými filmy nebo dutými vlákny o tloušťce 0,2 µm nebo 0,45 µm bylo také popsáno jako velmi účinné.
Studie společnosti Tecnologica (IBET) na Oeiras Institute of Experimental Biology v Portugalsku použila NFF k objasnění VLP hepatitidy C exprimované bakuloviry bez centrifugace. Nominálně hodnocené polypropylenové filtry (10,5,0.6 a 0.3μm) filtry se používají k vyjasnění sklizně VLP. Pro filtraci ve sběrných centrech VLP se používají stejné filtry s velikostí pórů 0,6μm a 0,3μm. Všechny studované filtráty byly testovány na míru obnovy HCV-VLP a byly porovnány doporučené filtrační metody. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.
Výsledky ukázaly, že 5μm-0.3μm filtr měl nejvyšší výtěžnost produktu (100 %) pro přímo sklizené krmivo VLP hepatitidy C. Polypropylenový 0,6μm filtr měl nejvyšší výtěžnost produktu (82 %) pro centrální přívod a clearance DNA hostitelské buňky byla asi 70 %.
2.2.1.4 Částice podobné virům produkované v bakteriálních nebo kvasinkových systémech
Typ metody čiření pro VLP vakcíny exprimované v bakteriálních nebo kvasinkových systémech závisí na uvolňování VLP do extracelulárních mediátorů. Pokud nemohou být VLP účinně secernovány, může být před vlastním krokem vyčeření vyžadována buněčná lýza nebo jiné extrakční kroky. Zatímco toto je zlatý standard v průmyslu čištění proteinů, centrifugace (kontinuální nebo dávková) vyjádřená v systémech na bázi bakterií nebo kvasinek, v poslední době se membránové procesy staly velmi atraktivní alternativou díky jejich snadné škálovatelnosti a kompatibilitě s jednorázovým použitím. léčby.
Richter a Topell vysvětlují použití centrifugace, TFF nebo kombinace obou při přípravě VLP produkovaných v čiřené E. coli. V jejich práci byly 0.45m TFF membrány použity k ředění a čiření homogenizovaných homogenátů E. coli při teplotě 5 stupňů . Rovněž poznamenávají, že membránový TFF je vhodný pro manipulaci s vysoce viskózními sklizněmi, přednostně s použitím TFF jednotek s konfigurací otevřených kanálů.
Odstředivé čiření bylo také hodnoceno jako alternativa k TFF. V tomto případě se výsledný homogenát neředil a centrifugoval při 4 stupních po dobu 105 minut, 10000g. Bez přenášení měkkého povlaku byl supernatant vylit z částic a znovu centrifugován při 4 stupních a 10 000 g po dobu 60 minut. Supernatant byl poté odstraněn z přítomných částic, zředěn EB pufrem (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 a přefiltrován na 0,22 m sterilním filtračním zařízení. Další zpracování. Proces zvětšování měřítka pro výrobu této VLP vakcíny v E. coli v měřítku 800 1 byl také údajně objasněn kombinací centrifugace a TFF.
Rekombinantní vakcína proti hepatitidě E HEV 239 byla v Číně licencována pro imunizaci dospělých ve věku 16 let a starších. Vakcinační antigeny (VLP) jsou exprimovány v E. coli a bylo prokázáno, že měřítko procesu produkce antigenu je v měřítku 50l. Produkt byl extrahován krakováním E. coli a inkluzní tělíska byla oddělena od buněčných fragmentů silným promytím pufrem obsahujícím 2% Triton X-100 a poté rozpuštěna v 4M homogenizátoru s močovinou. TFF objasňuje VLP lidského papilomaviru produkovaného v Saccharomyces cerevisiae (15L). Buněčný lyzát ošetřený nukleázou byl vyčištěn mikrofiltrací s křížovým tokem v transfiltračním režimu s použitím 0,65 um filtru z dutých vláken. Stejný postup se používá při výrobě vakcín. Ačkoli jen hrstka vakcín na bázi VLP dosáhla komerčního měřítka, několik vakcín na bázi VLP je ve vývoji, z nichž většina je objasněna pomocí centrifugace nebo membránové technologie.
Omezeni vlivem prostoru se o druhou polovinu obsahu podělíme v další kapitole. V příštím článku se podělíme o některé případy objasnění vakcín a použití příslušných membránových komponent.
Společnost Guidling Technology jako první společnost v oblasti lokalizace nashromáždila dostatečné relevantní zkušenosti s objasňováním vakcín. Guidling Technology je vývojová a produkční společnost se zaměřením na biofarmaceutické a buněčné kultury, purifikaci a separaci. Produkty jsou široce používány v biomedicíně, diagnostice, průmyslové filtraci tekutin, detekci, čiření, čištění a koncentračním procesu; Guidling úspěšně vyvinul ultrafiltrační centrifugační zkumavku, ultrafiltrační/mikrofiltrační membránovou kazetu, filtr pro odstranění virů, filtrační zařízení s tangenciálním průtokem, hluboký membránový zásobník atd., které plně splňují aplikační scénáře biofarmaceutických a buněčných kultur.
Naše membrány a membránové filtry jsou široce používány při zahušťování, extrakci a separaci předfiltrace, mikrofiltrace, ultrafiltrace a nanofiltrace. Naše široká škála produktových řad, od malých laboratorních filtrací na jedno použití až po produkční filtrační systémy, testování sterility, fermentace, buněčné kultury a další, dokáže vyhovět potřebám testování a výroby.
