Základní principy a pracovní postup syntézy peptidů v pevné fázi- (SPPS)
Syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS)je způsob syntézy peptidů na pevném nosiči. Mezi hlavní strategie SPPS patříBoc metodaaMetoda Fmoc. Syntéza peptidů je opakující se proces sekvenčního přidávání aminokyselin a obecně se provádí zC-konec (karboxylový konec)kN-konec (aminokonec). Nejprve je karboxylová skupina první aminokyseliny cílového peptidu kovalentně připojena k pevnému nosiči (pryskyřici). Použitím aminoskupiny této aminokyseliny jako výchozího bodu se odstraní N-koncová ochranná skupina a rostoucí peptidový řetězec se prodlouží reakcí s přebytkem aktivované druhé aminokyseliny. Tento cyklus-spojka → mytí → deprotekce → neutralizace a mytí → další spojka- se opakuje, dokud není dosaženo požadované délky peptidu. Nakonec je peptidový řetězec odštěpen od pryskyřice a purifikován, aby se získal cílový peptid. Když je -aminoskupina chráněna pomocíBoc (terc-butyloxykarbonyl), metoda je označována jakoSyntéza peptidů v pevné fázi-na Boc-. Když je -aminoskupina chráněna pomocíFmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonyl), je známý jakoSyntéza peptidů v pevné fázi-na Fmoc.
Syntéza peptidů v pevné fázi-na bázi Boc- (Boc metoda)
VBoc metoda, Boc skupiny odstranitelné kyselinou trifluoroctovou (TFA)se používají k ochraně -aminoskupin, zatímcochránící skupiny benzyl-typuse používají pro postranní řetězce. Během syntézy je Boc-chráněná -aminokyselina nejprve kovalentně navázána na pryskyřici. Skupina Boc se poté odstraní pomocí TFA a výsledný volný amino-konec se neutralizuje triethylaminem. Další aminokyselina se aktivuje pomocíDCC (dicyklohexylkarbodiimid)a připojeny k prodloužení peptidového řetězce. Po dokončení sestavení se cílový peptid odštěpí od pryskyřice typicky za použití silné kyselinybezvodý fluorovodík (HF)nebokyselina trifluormethansulfonová (TFMSA)Při metodě Boc syntézy se vyžaduje opakované kyselé zpracování k odstranění chránících skupin před každým kopulačním krokem. To může vést k několika vedlejším reakcím, jako je předčasné odštěpení peptidu z pryskyřice a nestabilita aminokyselinových postranních řetězců za kyselých podmínek, což vede k nežádoucím vedlejším reakcím.
Syntéza peptidů v pevné fázi-na Fmoc{1}} (metoda Fmoc)
V1978, Meienhofer a Athertonvyvinula strategii syntézy peptidů pomocíFmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonyl)jako -skupina chránící aminoskupinu, známá jakoMetoda Fmoc. V tomto přístupu je -aminoskupina chráněna pomocízákladní-labilní Fmoc, zatímco boční řetězce jsou chráněny pomocíkyselé-labilní ochranné skupiny typu Boc-.Hlavní výhodou Fmoc jako amino-ochranné skupiny je jejístabilita v kyselých podmínkách; není ovlivněna ošetřením činidly jako napřkyselina trifluoroctová (TFA)a lze je selektivně odstranit pomocímírný základ. Současně jsou ochranné skupiny postranního-řetězce, jako je Boc, stabilní za bazických podmínek a jsou odstraněny působením kyseliny. Nakonec je peptid kvantitativně odštěpen z pryskyřice pomocíTFA/dichlormethan (DCM), vyhýbá se použití silných kyselin a tím zlepšuje bezpečnost a kompatibilitu s rutinní syntézou peptidů.
Historie vývoje syntézy peptidů v pevné fázi- (SPPS)
1. Základní fáze (počátek 20. století až 1963)
V1902, Emil Fischerbyl první, kdo prozkoumal syntézu peptidů, ale pokrok byl pomalý kvůli technickým omezením. Používaly se rané syntézybenzoylové a acetylové ochranné skupiny, které bylo obtížné odstranit a často k nim vedlyštěpení peptidového řetězce.
V1932, Max Bergmanna spolupracovníci-představilibenzyloxykarbonyl (Z) skupinajako -skupinu chránící aminoskupinu. Tato skupina může být odstraněna podkatalytická hydrogenace nebo kyselé podmínky, poskytující spolehlivější nástroj pro syntézu peptidů a pokládající základy pro vývoj syntézy peptidů v pevné -fázi v 60. letech minulého století.
Během1950svědci úspěšně syntetizovali různébiologicky aktivní peptidy, jako napřoxytocin a inzulín. Tyto úspěchy dále pokročily v chemii peptidů a vytvořily základy pro vznik syntézy peptidů v pevné fázi-.
2. Průkopnická etapa (1963)
V1963, Robert B. Merrifieldnavrhlametoda syntézy peptidů v pevné fázi (SPPS)., ve kterémC-koncová aminokyselinaje ukotven k pryskyřici a peptidový řetězec se prodlužuje opakovanými cyklydeprotekci a kopulaci. Tento přístup značně zjednodušil proces syntézy peptidů a stal se z nějpreferovaný způsobpro sestavení peptidu.
Použitý MerrifieldBoc (terc-butyloxykarbonyl)k ochraně -aminoskupiny. Koncem 60. let také vyvinulprvní plně automatizovaný syntetizátor peptidůa úspěšně syntetizoványbiologické proteinyjako napřribonukleáza (124 aminokyselin). Za tyto převratné úspěchy byl Merrifield oceněnNobelova cena za chemii v roce 1984.
3. Fáze technologické inovace (1972)
V1972, Lou Carpinovyvinula9-fluorenylmethyloxykarbonylová (Fmoc) ochranná skupina, což může býtjemně odstranit za základních podmínek, snížení vedlejších reakcí. Díky tomu byl zvláště vhodný prokomplexní peptidyaautomatizovaná syntéza.
TheMetoda Fmocpostupně nahradila Boc metodu jako mainstreamovou strategii. Automatizované syntetizátory peptidů založené na obouChemie Fmoc a Bocbyly následně vyvinuty, říditautomatizace syntézy peptidůa výrazně zlepšuje účinnost a reprodukovatelnost.
4. Fáze zralosti a expanze (90. léta až do současnosti)
Optimalizace pryskyřice a činidel:Vývojhydrofilní PEG-modifikované pryskyřice s vysokým{0}}náplnía účinná vazebná činidla, jako je napříkladHBTUaHATUvýrazně zlepšila účinnost a výtěžek syntézy peptidů v pevné fázi (SPPS).
Technologická integrace:Nové přístupy jakomikrovlnná-syntézaaprůtoková chemiemají zkrácené reakční doby a dále zvýšené výtěžky.
Základní principy a pracovní postup SPPS:
Základním principem syntézy peptidů v pevné -fázi jepostupná konstrukce peptidového řetězce na pevném nosiči, pomocístrategie ochranných skupinakondenzační (kopulační) reakcedosáhnoutefektivní a kontrolovatelné sestavení peptidu.
1. Role pevné podpory (pryskyřice) v syntéze peptidů v pevné fázi (SPPS)-
A nerozpustná polymerní pryskyřice-jako napřpolystyrenová-divinylbenzenová síťovaná-pryskyřice, Wangova pryskyřice nebo Rink amidová pryskyřice-je vybrána jako pevná podpora v SPPS. Pryskyřičný povrch obsahujefunkční skupiny(např. hydroxylové nebo aminoskupiny), které se mohou tvořitkovalentní vazby s jedním koncem peptidového řetězce, obvykleC-konecToto kovalentní připojení zajišťuje, že rostoucí peptidzůstává navázaný na pryskyřici po celou dobu syntézy, což značněusnadňuje následné reakční kroky, promývání a čištění
2. Ochrana skupinové strategie při syntéze peptidů v pevné fázi- (SPPS)
Během syntézy peptidů se-aminoskupina, karboxylová skupina a reaktivní postranní-funkční skupiny řetězceaminokyselin (jako jsou thiolové, karboxylové a aminoskupiny) jsou náchylné kvedlejší reakce. Aby se předešlo těmto nežádoucím reakcím,chránící skupinyse používají. Mezi běžné ochranné skupiny patří:-Skupiny na ochranu aminokyselin:
Boc (terc-butyloxykarbonyl):Kyselina-labilní, snadno odstranitelnákyselé podmínky.
Fmoc (9-fluorenylmethyloxykarbonyl):Stabilní za kyselých podmínek, lze odstranit zazákladní podmínky(např. roztok piperidin/DMF).Postranní-skupiny na ochranu řetězce:Vybírá se podle chemických vlastností postranního řetězce aminokyseliny.obecné skupiny zahrnujíbenzyl (Bn), terc{0}}butyl (tBu), trityl (Trt)atd. Tyto skupiny jsouodstraněny na konci syntézyobvykle během štěpení peptidu z pryskyřice, za použitíkyselina nebo jiné specifické podmínky.
3.C-Konec k syntéze N-konců v SPPS
Vsyntéza peptidů v pevné fázi (SPPS)sestavení peptidu obvykle začíná vC-konec (karboxylový konec)a postupuje po krocích směrem kN-konec (aminokonec). Je to proto, žeC-koncová aminokyselina je nejprve připojena k pevnému nosičia následné aminokyseliny jsou navázány navolná aminoskupina peptidového řetězce již navázaná na pryskyřici, postupné prodlužování peptidového řetězce.
4. Coupling Reaction v pevné fázi-syntézy peptidů (SPPS)
Chráněné aminokyseliny musí býtaktivovánotakže jejichkarboxylové skupiny se stávají reaktivními, což jim umožňuje vytvořit apeptidová vazbas aminoskupinou peptidu vázaného na pryskyřici-. Společnýaktivační činidlazahrnoutkarbodiimidy(např. DCC, DIC),HOBt, HATUaPyBOP. Jakmile je aktivována, karboxylová skupina reaguje s volnou aminoskupinou v akondenzační reakce, tvořící anamidová vazbaa tím připojení nové aminokyseliny k rostoucímu peptidovému řetězci.
5. Opakující se (cyklické) operace v syntéze peptidů v pevné fázi- (SPPS)
Proces zahrnujeopakování cyklu deprotekce → kondenzace → promývání, přidáníjedna aminokyselina na cyklusk postupnému prodlužování peptidového řetězce. Po každémkopulační reakce, pryskyřice jevyprané(např. s rozpouštědly, jako je DMF nebo DCM) k odstranění nezreagovaných činidel, vedlejších-produktů a přebytečných aminokyselin. The-aminoskupina nově přidaného zbytku je poté zbavena ochrany, vystavení volného aminu pro přípravu na další kopulační reakci. Tento cyklus se opakuje, dokud není plně sestavena požadovaná peptidová sekvence.
6. Štěpení v pevné fázi-syntéza peptidů (SPPS)
Jakmile peptidový řetězec dosáhne požadované délky, je tomu takodštěpené od pevného nosičesoučasně s použitím vhodného činidlaodstranění všech chránících skupin. Běžně používané štěpící činidlo jekyselina trifluoroctová (TFA), který nejenpřeruší vazbu mezi peptidem a pryskyřicíale takéodstraňuje chránící skupinyjako je Fmoc a Boc, obnovení peptidu na jehorodný stát. Jakmile peptidový řetězec dosáhne požadované délky, je tomu takodštěpené od pevného nosičesoučasně s použitím vhodného činidlaodstranění všech chránících skupin. Běžně používané štěpící činidlo jekyselina trifluoroctová (TFA), který nejenpřeruší vazbu mezi peptidem a pryskyřicíale takéodstraňuje chránící skupinyjako je Fmoc a Boc, obnovení peptidu na jehorodný stát.
Prostřednictvím těchto kroků,syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS)umožňujeúčinné a kontrolované sestavení peptidových řetězců na pevném nosiči, čímž se výrazně vyhnete složitým mezistupňům čištění vyžadovaným při tradiční syntéze-rozpouštěcí fázezlepšení účinnosti syntézy a výtěžku.
Prostřednictvím těchto kroků,syntéza peptidů v pevné fázi (SPPS)umožňujeúčinné a kontrolované sestavení peptidových řetězců na pevném nosiči, čímž se výrazně vyhnete složitým mezistupňům čištění vyžadovaným při tradiční syntéze-rozpouštěcí fázezlepšení účinnosti syntézy a výtěžku.
