Shrnutí:

Tento článek shrnuje dva klíčové faktory, které je třeba vzít v úvahu ve strategiích čištění proteinů: následné požadavky na aplikaci a biologické charakteristiky samotných proteinů. Článek zdůrazňuje, že vysoce kvalitní čištění proteinů je základem pro spolehlivost a opakovatelnost experimentálních dat, zejména pro produkci rekombinantních proteinů. Různé scénáře aplikací mají specifické požadavky na čistotu proteinů, aktivity nebo obsah endotoxinu a vlastnosti proteinů mohou výrazně ovlivnit strategie čištění. Podle konkrétních případů článek ilustruje, že jedinečné proteiny by měly přijmout přizpůsobené schémata čištění. Nakonec byl navržen proces systematického produkce proteinů (obrázek 1), zdůrazňoval kontrolu kvality plného procesu od výběru expresních systémů, konstrukční návrh po optimalizaci čištění a doporučení hodnocení proteinové homogenity a funkčnosti prostřednictvím biofyzikálních technik (jako jsou SEC-muls, DSF atd.). Cílem tohoto článku je poskytnout praktické pokyny pro výzkumné pracovníky a pomáhat jim formulovat efektivní a opakovatelné strategie čištění na základě charakteristik a aplikačních požadavků cílových proteinů, čímž se zvyšuje kvalita a efektivitu vědeckého výzkumu.

 

Obrázek 1. Schematický diagram procesu výroby proteinů

 

Produkce proteinů s vysokým poptávkou - příklady identifikace problému, návrh strategie zmírňování a odpovídající výstup

 

1. Vazba kyseliny kyseliny na protein:

Při čištění proteinů vázajících nukleovou kyselinu je zapotřebí více kroků k odstranění kontaminace nukleové kyseliny. Během lýzy je třeba přidat nukleázy (jako je Nuclease (Benzonase®) nebo DNáza nebo RNáza), ale vázané nukleové kyseliny nelze zcela odstranit. Vyměňte kroky odstraňování nukleové kyseliny, jako je srážení sulfátu PEI nebo streptomycinu, čištění heparinu nebo chromatografii iontoměnitosti. Přítomnost nukleových kyselin byla monitorována poměrem A26 0 nm\/a28 0 nm během procesu čištění. Pokud byl poměr nižší než 0,6, naznačil to, že čistota proteinu byla relativně vysoká a kontaminace nukleové kyseliny byla minimální. U proteinů s silně vázanými nukleovými kyselinami je lze dočasně denaturováno (jako je léčeno močovištěm) a poté znovu nasunuty. Klíčové body: Použijte vysoce kvalitní činidla, čerstvé pufry a čisté sloupy (před použitím čisté s 0,5 m NaOH).

 

2. těžký řetězec Ferritinu myši:

Účelem produkce purifikovaného myšího feritinového těžkého řetězce (MFTH1) proteinu s vysokým rozlišením kryo-elektronovou mikroskopií s jedním částí (Cryo-EM). Expresní vektor Escherichia coli kódovaný neznačený MFTH1 byl ultrasonicky narušen bez přidání jakékoli nukleázy. Po zahřátí na 7 0 stupně podstoupila srážení síranu amonia, dialýzy a chromatografické kroky pro vylučování velikosti. Výsledný vzorek ukázal přítomnost velkého množství kontaminantů na obrázcích kryo-elektronové mikroskopie (obrázek 2A), což bylo pro jeho aplikaci zcela nevhodné. Optimalizujte kroky. Přidejte SM nukleázu během procesu lýzy buněk a dialyzační proces po srážení síranu amonného a poté přidejte krok chromatografie aniontu ke snížení poměru A26 0 nm\/a280nm z 1,4 na 0,8. Po chromatografii vylučování velikosti byl poměr A260NM\/A280NM konečného vzorku MFTH1 0,56. SDS-PAGE a kryo-elektronovou mikroskopickou obrazu (obrázek 2B) ukázaly, že protein byl velmi čistý, což naznačuje, že kontaminanty byly účinně odstraněny.

Obrázek 2 těžký řetězec myš Ferritinu

 

 

 

3. Chimérní protein lidský DSRBEC (DSRBD-EGF-chiméra):

DSRBEC je tvořen fúzí dvouřetězcové vazebné domény RNA (DSRBD) lidské proteinové kinázy R a lidského epidermálního růstového faktoru (HEGF). Když je DSRBD exprimován v Escherichia coli, vykazuje extrémně vysokou vazebnou schopnost dsRNA. Po buněčné lýze bude kontaminentní RNA bránit vazbě rekombinantních proteinů na sloupec afinitní chromatografie s pevným kovovým ionty (IMAC). Konvenční metody, jako je srážení sulfátu PEI nebo streptomycinu, ošetření RNázy nebo roztoky vysokého soli pufru, nemohou odstranit RNA. Lýza buněk byla provedena pomocí pufru obsahujícího 4M močoviny. Supernatant byl naložen na sloupec IMAC a 4M až 0 m močovina byla pomalu používána přes noc (renaturace sloupce). Renaturační pufr byl přidán s imidazolem a eluován ze sloupce iMac. Konečné zdokonalení bylo provedeno pomocí filtrace Gel Superdex 75, aby se získala funkčně aktivní DSRBEC.

 

4. Proteiny vázané na dvojmocné kationty nebo jiné kofaktory:

U proteinů, které interagují s divalentními kationty, jako je Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ nebo jinými kofaktory, je zásadní přidat během výrazu konkrétní dvojmocné kationty (nebo jiné kofaktory). Během procesu čištění je také nutné malé množství stejných dvojmocných kationtů (nebo jiných kofaktorů). Je však třeba se vyhýbat použití jakýchkoli chelatačních látek (jako je EDTA, EGTA) a chelatační redukční činidla (jako je DTT nebo DTE). Při jednání s proteiny vázanými na dvojmocné kationty musí být k potvrzení skutečné přítomnosti dvojmocných kationtů (nebo jiných kofaktorů) v purifikovaném proteinu (jako atomová absorpční spektrofotometrie) použita směs proteázových inhibitorů bez chelačních činidel).

 

5. Rekombinantní ferridoxin (RFD) obsahující jediný shluk [2FE ± 2S] z termofilních cyanobakterií mastigocladus laminosus

Ferridoxin je rozpustný protein železa, který se účastní reakcí na přenos elektronů. Ferroredoxin typu rostlin nese jediný shluk [2FE ± 2S] jako elektronový akceptor fotosystému I. Kmen Escherichia coli BL21 (DE3) exprimoval rekombinantní RFD protein v TB médiu obsahujícím 10 mm fecl3 a antibiotiku. Eluce sloupce IMAC zachycení byla provedena pomocí pufru obsahujícího 10mm histidin, aby se zabránilo imidazolu a zabránilo destrukci klastru [2FE ± 2S]. Pro další čištění a koncentraci do 12 mg\/ml pro krystalizační screening byla použita chromatografie aniontů a vylučování velikosti. Ve srovnání s rekombinantní produkcí ferroredoxinu dosáhl přirozený ferroredoxin purifikovaný z modrozelených řas mastigocladus laminosus během krystalizace vyššího rozlišení.

 

6. Proteiny používané jako antigeny

Proteiny se často používají jako antigeny k obnovení cílových ligandů. První věc, kterou je třeba zvážit, je, zda se protein používá pro imunitu in vivo k získání konvenčního monoklonálního nebo polyklonálního IgG nebo pro programy zahrnující procesy výběru velblouda nebo in vitro.

 

6.1 Antigeny používané pro produkci rutinní protilátky

Když se antigeny používají k produkci monoklonálních IgG protilátek, správné skládání antigenu obvykle není nutné, protože většina monoklonálních protilátek rozpoznává lineární epitopy, které nejsou velmi ovlivněny strukturou antigenu, a dokonce i denaturované antigeny (jako jsou proteiny inkluze) zůstávají účinné. Čistota však musí být přísně kontrolována, aby se zabránilo silným imunogenním kontaminantům zasahujícím do imunitní odpovědi a způsobilo dominanci necílových protilátek.

 

6.2 Screening knihovny konjugátů

Zvláštní pozornost by měla být věnována udržování přirozené konformace antigenu během zpracování knihovny nanobody získané imunizací velbloudů. Na rozdíl od konvenčních protilátek mají velbloudí protilátky (zejména nanobody) inklinují strukturální epitopy, které souvisí s jejich jedinečnou konvexní strukturou doplňkového místa. Podobně při screeningu velkých syntetických nebo přírodních protilátkových knihoven in vitro musí antigen udržovat strukturu, která je zcela v souladu s cílovou aplikací. Vzhledem k tomu, že samotný proces screeningu není zkreslený, pokud má antigen nesprávné složení, agregace nebo konformační heterogenitu, může být prověřeno velké množství konjugátů zaměřených na nepřirozené epitopy.

 

 

 

7. Proteiny obsahující mezimolekulární nebo intramolekulární disulfidové vazby nebo volný cystein

Disulfidové vazby jsou zásadní pro stabilizaci přirozené struktury proteinů. Během procesu čištění je při čištění proteinů obsahujících mezimolekulární nebo intramolekulární disulfidové vazby nutné vyhnout se přidávání redukčních činidel, aby se zabránilo konformačním změnám proteinů, čímž se změnilo jejich funkce. U proteinů obsahujících volný cystein jsou redukční činidla nezbytná ve všech krocích procesu čištění, zejména během skladování, aby se zabránilo tvorbě umělých disulfidových vazeb. Nejčastěji používanými redukčními činidly jsou dithiothreitol (DTT), -Mercaptoethanol (-me) a Tris (2- karboxyethyl) fosfin hydrochlorid (TCEP). U pryskyřic IMAC, které jsou nekompatibilní s DTT nebo TCEP, se doporučuje použít -Me a nahradit je dalšími redukčními látkami v následujících krocích.

 

8. Fragment rekombinantní protilátky

Ačkoli struktura rekombinantních fragmentů protilátek (jako jsou nanobody) je jednodušší než struktura IgG, jejich funkce závisí na správné tvorbě disulfidových vazeb. V bakteriálních expresních systémech, dokonce i při přijetí optimalizačních strategií, se mohou stále vyskytnout špatně nebo částečně složené produkty, které existují jak v rozpustné části, tak v inkluzním těle. Více skryté je, že i správně složené fragmenty protilátek mohou tvořit rozpustné agregáty (koloidní agregace) hydrofobními plaky na povrchu. Takové agregáty je obtížné identifikovat v rutinních funkčních testech (jako je ELISA), protože multivalentní vazba může maskovat pokles monomerní afinity, ale jejich přítomnost může vážně ovlivnit aplikace, které se spoléhají na velikost malé molekuly (jako je mikroskopie s super-rozlišením). Spoléhání se pouze na SDS-PAGE je proto nedostatečné k vyhodnocení kvality vzorku. Pro odlišení monomerů (hlavní píky) od agregátů (píky vyloučení) musí být přijaty biofyzikální metody, jako je gelová filtrace (obrázek 3). Klíčové kontrolní body zahrnují: Optimalizace redoxního prostředí během exprese pro podporu tvorby disulfidové vazby a optimalizace podmínek skladování po očištění, aby se zabránilo agregaci. Tato opatření jsou zásadní pro zajištění monodisperzity a funkce fragmentů protilátek.

Obrázek 3. Gel Filtrace Separace rozpustných agregátů nanobovin

 

9. Rozpustné fragmenty receptoru lymfocytů LLT1

Rekombinantní exprese proteinů závislých na disulfidové vazbě (jako je receptor lymfocytů LLT1) často čelí skládacím potížím. Gelová filtrace LLT1 divokého typu vykazovala agregační píky a píky dimeru (obrázek 4a), ale hmotnostní spektrometrie odhalila nesprávné složení způsobené nepárovým cysteinem v dimeru (obrázek 4B). Za tímto účelem byly navrženy dva mutanty: jeden odstranil problém cystein, což mělo za následek náhlý pokles výnosu (obrázek 4A); Po zavedení neocysteinu k rekonstrukci konformované disulfidové vazby měl mutant nejen vysoký výnos a dobrou stabilitu, ale také mohl krystalizovat (obrázek 4C) a 3D struktura potvrdila, že mutant vytvořil správnou disulfidovou vazbu a udržoval přirozené skládání. Tento případ ukazuje, že racionálním navrhováním konformních disulfidových vazeb v kombinaci s gelovou filtrací a analýzou hmotnostní spektrometrie lze efektivně vyřešit problém s skládání rekombinantních proteinů a lze získat funkční proteiny se stabilními strukturami a vysokými výtěžky.

Obrázek 4. rekonstrukce disulfidové vazby zlepšuje skládání a výnos rozpustného LLT1

 

 

 

10. Snadno agregovatelné proteiny

Čištění rekombinantních proteinů často čelí problému agregace a jeho tvorba sleduje mechanismus „nukleačního růstu“-nejprve se tvoří malé množství rozpustných agregátů a poté spustí rozsáhlé nerozpustné agregace. To address this challenge, multi-level strategies need to be adopted: At the expression stage, this can be achieved by optimizing the strain, reducing the culture temperature, using modified culture media or different solubilizing fusion proteins, and replacing expression systems (insect\/mammalian cells), etc. During the purification stage, rapid operation (in a 4 degree C environment) is required to avoid excessive protein concentration, and a "rapid purification strategy" (such as direct connection of IMAC na sec) by měl být přijat, aby se okamžitě odstranila agregovaná jádra. Obecně lze říci, že při screeningu roztoků pufru by se měly brát v úvahu faktory, jako je složení komponenty, hodnota pH, disociační činidlo nebo solubilizér (obrázek 5). Prostřednictvím jemné optimalizace ortogonální detekce (jako je SEC, CD, LS, DSF a teplotní posun na základě fluorescenčního tepla atd.) Byla stanovena kvalita proteinu a nejvhodnější roztok pufru.

Obrázek 5. Strategie pro zmírnění agregace proteinů

 

11. Krystalizace lidské CLK1 kinázy (jak získat reprodukovatelné šarže)

Pro získání homogenní nefosforylované kinázy CLK1 pro krystalizační studie bylo přijaty schéma spolupráce s více strategiemi. Za prvé, to bylo koexprimováno s λ -fosfatázou v Escherichia coli eliminovat heterogenitu autofosforylace. Ačkoli byl výnos snížen, byla zajištěna úplná defosforylace. Po zachycení IMAC byl eluent doplněn stabilizátory (50 mm arginin, 50 mm kyseliny glutamové a 10 mm DTT), aby se zabránilo agregaci, koncentrované a jeho značka byla odstraněna trávením TEV. Poté byl správný oligomer oddělen SEC (obsahující 5% glycerol a -me). Poslední klíčový krok aniontové výměny rozlišuje mezi krystalickými (nefosforylovanými) a nekrystalickými (částečně fosforylovanými) skupinami CLK1. Zvláště stojí za zmínku, že způsob buněčné lýzy významně ovlivňuje stabilitu proteinu-vysokotlaká a vysokoteplotní metoda vede k nevratné agregaci CLK1, což zdůrazňuje důležitost mírné léčby přípravy kinázy.

 

 

 

12. Produkce galektin -1 se stabilní schopností vázajícího ligand

Pro přípravu funkčního galektinu -1 Pro studie vázání ligandu byly porovnány strategie exprese a čištění čtyř konstruktů (neznačených a jeho značených galelektinu -1, neoznačené a jeho značené cysteinové mutant -1). Klíčová zjištění naznačují, že čištění chromatografie laktózy afinitní chromatografie může účinně prověřit správně složené proteiny, ale je třeba ji kombinovat s důkladnou dialýzou (HEPES pufr), aby se zcela odstranila laktóza z vazebného místa a obnovila aktivitu CRD. Galektin divokého typu -1 je náchylný k oxidaci a inaktivaci a jeho stabilita zůstává omezená i v přítomnosti redukujících činidel (obrázek 6). Mutant bez cysteinu však významně zvyšuje dlouhodobou stabilitu při zachování srovnatelné aglutinační aktivity a tepelné stability (ověřeno NanoDSF, ITC atd.) Odstraněním závislosti na disulfidové vazbě.

Obrázek 6. Hydrodynamická charakterizace rekombinantního galektinu -1 odhaluje jeho nestabilitu

 

13. odstranění endotoxinu

Metoda odstraňování endotoxinu je založena na afinitní chromatografii, včetně pozitivně nabité chromatografie (aniontová výměna), použití polykačních ligandů (jako je poly-l-lysin (PLL), imobilizovaný polyamin (polymyxin B)) a přidání tritonu X -114. Během procesu čištění věnujte pozornost přípravě vyrovnávacího roztoku vodou bez LPS a použijte nové sloupce nebo sloupce, které byly použity pouze při jiných čištění bez LPS. Pro kontaminaci endotoxinu může být chromatografický systém čerpadla\/tekutiny inkubován přes noc v 0. 5m NaOH nebo po dobu 4 hodin v 1. 0 m NaOH. Konečné množství LPS ve vzorku bylo vyhodnoceno pomocí limulus amebocytového lyzátového činidla (LAL) a bylo ověřeno, zda byl pod limitem potřebným pro specifickou aplikaci.

 

14. Proteinový komplex

Exprese a čištění proteinových komplexů je třeba optimalizovat podle specifických podmínek. Výzvy zahrnují nestabilitu nebo nesprávné složení podjednotek. Každá podjednotka může být exprimována nezávisle a sestavena in vitro nebo koexprimována za vzniku funkčních proteinových komplexů. Konstrukční konstrukce by měla být pečlivě zavedena s čištění nebo detekční štítky, aby se zabránilo narušení sestavy, zejména pokud jsou komplexní informace omezeny a jsou vyžadovány více optimalizace. Během procesu čištění je třeba vyhodnotit integritu a stabilitu komplexu. Metody zahrnují SDS-PAGE (detekce podjednotky), SEC (homogenita), SEC-MALS (analýza molární hmotnosti), hmotnostní fotometrie nebo přirozená hmotnostní spektrometrie (hmotnostní ověření). Je třeba poznamenat, že komplex se může disociovat při nízkých koncentracích. V této době je třeba optimalizovat chromatografickou metodu nebo pufr (například prostřednictvím podmínek screeningu tepelného driftu nebo DSF). Kromě toho snižování kroků čištění může zabránit ztrátě slabé interakční podjednotky a vyrovnat účinnost čištění a integritu komplexu.

 

 

 

15. Čištění komplexů antigenu a protilátky

Komplexy protilátky-antigen jsou typickými příklady proteinových komplexů. Jejich kokrystalizace může odhalit vazebné vzorce a vést optimalizaci inženýrství protilátek. Tradiční metody vyžadují samostatné čištění antigenů a protilátek a jejich míchání. Nedávné studie však ukázaly, že strategie koexprese a společný čištění jsou efektivnější. K získání komplexu je zapotřebí pouze jediné čištění a zároveň lze nestabilní antigeny stabilizovat protilátkami a lze dosáhnout i exprese bez štítků. V této specifické situaci jsou SDS-PAGE a Gel Filtration (SEC) obvykle dostačující k vyhodnocení čistoty a kvality komplexu.

 

Shrnutí

Čištění proteinů je základní technologie ve vědeckém výzkumu. Produkce proteinů akademického měřítka obvykle sleduje standardní strategie a může produkovat vysoce čistotu na úrovni miligramů, rozpustné proteiny, které se široce používají ve strukturální biologii, biochemii a funkčním výzkumu. Zvláštní požadavky navazujících aplikací (jako je potřeba endotoxinu v experimentech na zvířatech a žádná kontaminace nukleázy ve výzkumu nukleové kyseliny) však často vyžadují přizpůsobená řešení) nebo vlastní vlastnosti proteinů (jako je snadná agregace, obsahující disulfidové vazby nebo vysokou afinitu kyseliny nukleové). Tento přehled v reakci na tyto zvláštní okolnosti navrhuje rafinované strategie od výběru systémů exprese, návrh konstruktů (optimalizace štítků a hranic domén) až po proces čištění a zavádí kontrolu kvality (jako je SDS, detekce aktivity, atd.). Některé aplikace také vyžadují další analýzu (jako je detekce endotoxinu a stanovení zbytků nukleových kyselin), podobně jako koncept „zajištění kvality“ (QA) v biofarmaceutickém průmyslu, tj. K prevenci defektů prostřednictvím systematických procesů. Cílem je vytvoření pokynů pro kontrolu kvality a objasněním specifických standardů pro proteinové činidla používané ve vědeckém výzkumu, cílem je stanovit přísnější normy čištění proteinů pro akademické laboratoře, zvýšit spolehlivost a opakovatelnost experimentálních dat a překlenout propast mezi základním výzkumem a průmyslovými standardy.

 

Doi: 10.1186\/s 12934-022-01778-5