Jak si vybrat vhodnou ultrafiltrační trubici

Ultrafiltrační trubice běžně používané pro koncentraci proteinů a náhradu pufru se často používají v ultrafiltračních trubkách. Existují i jiné modely, které mají různé velikosti objemu a ultrafiltrační trubice v závislosti na molekulové hmotnosti cílového proteinu, objemu před koncentrací a cílovém objemu koncentrace. Opětovně použitelný.

1. Vyberte vhodnou ultrafiltrační trubici, zejména s ohledem na MWCO a objem koncentrace. Obecně platí, že molekulová hmotnost by neměla být větší než 1 / 3 molekulové hmotnosti cílového proteinu. Pokud je molekulová hmotnost cílového proteinu asi 10 kd, lze použít ultrafiltrační trubici se zachovanou molekulovou hmotností 3 KD.

2. Nově zakoupená ultrafiltrace je suchá. Před použitím přidejte vodu milliq. Voda prochází zcela membránou a je předchlazena v ledové lázni nebo chladničce po dobu několika minut. Poté vylijte vodu a přidejte proteinový roztok. Množství proteinového roztoku nesmí překročit bílou čáru na horní straně zkumavky. Snadná obsluha. Před přidáním proteinového roztoku musí být ultrafiltrační trubice vložena do ledu pro předchlazení.

3. Rovnováha. Hmotnost a těžiště musí být vyvážené. Všimněte si, že rychlost a zrychlení by neměly být příliš rychlé, jinak bude ultrafiltrační membrána přímo poškozena. Spusťte odstředivou ultrafiltraci (předchlazení odstředivky na 4 stupně). Směr membrány a rotujícího hřídele lze nastavit podle návodu (v případě úhlové odstředivky je membrána kolmá k hřídeli). Při skutečném použití je obecná rychlost nižší než rychlost uvedená v příručce, což může prodloužit životnost odstředivé trubky.

4. při koncentraci na zbývající 1 ml [vezměte 50ul bradfordský roztok pro domácnost, přidejte 10ul tekutinu, abyste zjistili, zda se změní na modrou, a zjistěte, zda ultrafiltrační trubice uniká protein. Pokud trubka uniká, nalijte ji do horní vrstvy a poté proudte zpět do nové trubice, abyste zahájili ultrafiltraci. Chcete-li přesně určit, zda zkumavka uniká, odstředivě 5 mg 10 minut odstředivka 10 minut, pak ji projděte, spusťte proteinový gel nebo Bradford] [hrubé měření]. Pokračujte v přidávání zbývajícího proteinového roztoku ke koncentraci (pracujte na ledu, aby se zabránilo zahřívání bílkovin), dokud se nepřidají všechny koncentrované roztoky. Během odstředění věnujte pozornost tomu, zda dochází k srážení proteinů a způsobuje zablokování trubice. Pokud dojde ke srážení, určete konkrétní příčinu srážení, zda je koncentrace bílkovin příliš vysoká nebo zda je pufr nevhodný; První z nich lze vyřešit použitím více ultrafiltračních trubic současně ke snížení koncentrace, zatímco druhá může měnit různé pufry, dokud se protein nevysráží.

5. Předchozí kroky se používají ke koncentraci bílkovin. Pokud má být pufr vyměněn, když je celkový proteinový roztok koncentrován na asi 1 ml, jemně přidejte nový pufr (ultrafiltrace přes 0,22um ultrafiltrační membránu) a poté kontinuálně koncentrujte na asi 1 ml po dobu tří, takže konečná koncentrace závisí na požadované koncentraci proteinu, která obvykle není větší než 500ul nebo méně než 200ul. Podle objemové koncentrace nejméně 10krát pokaždé je to více než 1000krát více než třikrát, což může v podstatě dosáhnout účelu změny pufru.

6. Odstraňte konečný proteinový koncentrát. Provoz na ledu. Pomocí žluté pipetovací špičky (200 ml) jemně vložte špičku pipety podél okraje a poté jemně vyfoukněte a promíchejte proteinový roztok. Dávejte pozor, abyste se nedotýkali ultrafiltrační membrány. Nasávejte koncentrovaný roztok na 200ul pokaždé, dokud není úplně nasáván. Není nutné extrahovat poslední koncentrovaný roztok na dně zkumavky, jinak je to příliš obtížné a ultrafiltrační membrána může být poškozena. Nakonec se do ultrafiltrační trubice přidá voda milliq, aniž by prošla ultrafiltrační membránou, aby se zabránilo ztrátě vody a vysychání membrány.

7. Níže jsou uvedeny kroky pro ošetření ultrafiltrační trubice a opětovné použití ultrafiltrační trubice.

8. Nalijte vodu do ultrafiltrační trubice a několikrát jemně opláchněte milliq vodou. [pokud je na dně zkumavky zřejmé srážení bílkovin, můžete nejprve přidat vodu a poté ji odfouknout pipetou. Dávejte pozor, abyste se nedotýkali membrány. Sediment visí dolů a pak uteče. Nemůžete ji spláchnout vodou z vodovodu. Po přidání 0,2 m roztoku NaOH jej umístěte na 20 minut při pokojové teplotě a během této doby vyvažte ultrafiltrační trubici. Odstředivka se odstředí dalších 10 minut. Vylijte zbývající roztok NaOH a ponořte bavlněné jádro do kádinky (1 nebo 2l) milliq vody, umístěte na několik hodin a poté vyměňte za novou vodu, umístěte na několik hodin, aby se nepřetržitě zředila koncentrace NaOH. Umyjte zkumavku o objemu 50 ml a přikryjte vodou z vodovodu a vnitřní stěnu umyjte vodou milliq.

9. Vyjměte ponořené jádro zkumavky, přidejte jej do plné vody milliq a poté naplňte 50 ml zkumavku vodou milliq. Pomalu vložte jádro trubice do 50 ml.

Odstředivá trubice, vypusťte a rozdělte vodu, poté zakryjte a skladujte při 4 stupních až do dalšího použití. Obecně řečeno, podle výše uvedených kroků a opatření se každá zkumavka nerozbije během tří nebo čtyř let.