Úplná analýza procesu výroby léčiv MRNA: Jak technologie TFF řeší problémy spojené s čištěním
V posledních letech dosáhla technologie mRNA průlomového pokroku v biofarmaceutické oblasti a prokázala obrovský aplikační potenciál, zejména ve vakcínách a genové terapii. Úspěšný vývoj mRNA vakcín přinesl nejen nová řešení pro prevenci a kontrolu infekčních onemocnění, ale také vedl k pokroku v imunoterapii rakoviny a personalizované medicíně. Jako nová třída terapeutických produktů je-výroba mRNA ve velkém měřítku velmi náročná, zahrnuje kontrolu stability RNA, odstranění zbytkových enzymů a reakcí vedlejších-produktů, výměnu pufru a dosažení vysoké-rychlosti obnovy čistoty, což vše vyžaduje výrobní technologie s regulačními-schválenými řešeními.
Výrobní proces mRNA vakcín nebo terapeutik je rozdělen především do tří fází: příprava roztoku plazmidové DNA, příprava roztoku mRNA a příprava léčivého produktu mRNA–LNP.
Vývojový diagram procesu výroby léčiva mRNA
Filtrace s tangenciálním tokem (TFF), jako dobře -zavedená technologie membránové separace, je široce používána při výrobě mRNA díky své vysoké-účinnosti molekulárního síta, řiditelné výměně pufru a charakteristikám nízkého smykového napětí. Na základě konstrukce membránových modulů zahrnují běžné konfigurace TFF ploché -plechové kazety a moduly s dutým-vláknem. Kromě toho lze tlakovou- membránovou separaci v TFF rozdělit na mikrofiltraci (MF), ultrafiltraci (UF), nanofiltraci (NF) a reverzní osmózu (RO) podle velikosti pórů membrány s postupně se zvyšující selektivitou.
TFF hraje kritickou roli ve více fázích výroby léčiv mRNA, včetně přípravy objemu plazmidové DNA, hromadné výroby mRNA a konečné formulace léčivých produktů mRNA-LNP. Prostřednictvím vhodného výběru typu membrány, molekulové hmotnosti cut-off (MWCO) a materiálu membrány umožňuje TFF účinné odstranění reakcí -produktů a nečistot s nízkou-molekulární- hmotností a zároveň usnadňuje výměnu pufru a koncentraci před i po zapouzdření LNP. To výrazně zvyšuje čistotu RNA, stabilitu a celkovou škálovatelnost procesu.
Kromě toho je výkon filtrace tangenciálního toku ovlivněn faktory konfigurace systému, jako je typ čerpadla a konstrukce potrubí, stejně jako klíčové parametry procesu včetně transmembránového tlaku (TMP), smykového napětí a filtračního toku. Tyto faktory je třeba pečlivě vybrat a optimalizovat na základě charakteristik cílového produktu, zejména u produktů citlivých na stres, jako je mRNA–LNP, které jsou během zpracování vysoce citlivé na vnější mechanické síly.
Purifikace plazmidové DNA
Příprava zásobního roztoku plazmidové DNA je zásadně založena na sekvenčním návrhu transkripčního templátu. Způsoby přípravy typicky zahrnují amplifikaci plazmidové DNA, ačkoli může být také použita PCR amplifikace. Vezmeme-li příklad amplifikace DNA, zkonstruovánoE. colise běžně používá pro amplifikaci-založenou na fermentaci. Následný proces čištění zahrnuje hlavně sběr buněk, lýzu a čiření, koncentraci a výměnu pufru, sterilní filtraci, linearizaci a chromatografické čištění. V průmyslovém prostředí se pro sběr buněk často používá kontinuální{3}}průtoková centrifugace, která však generuje relativně vysoké smykové síly. Systémy dutých vláken se svými otevřenými kanály a nízkým střihem jsou vhodnější pro manipulaci se vzorky s vysokým obsahem pevných látek, vysokou viskozitou nebo citlivostí na střih, jako je plazmidová DNA. Po odběru jsou buňky podrobeny vysokotlaké- homogenizaci, ultrazvuku nebo alkalické lýze, po které následuje předběžné vyčeření pomocí hloubkové filtrace.
Pro usnadnění následné chromatografie se často nejprve pro koncentraci a výměnu pufru používá filtrace s tangenciálním tokem (TFF) pomocí membránových kazet nebo kolon s dutými vlákny s mezní hodnotou molekulové hmotnosti- 30 kDa, 100 kDa nebo 300 kDa. Tím se sníží objem vzorku a současně se odstraní některé nečistoty, jako je RNA, proteiny hostitelské buňky (HCP) a fragmenty DNA hostitelské buňky (HCD). Chromatografie slouží jako krok čištění jádra. Typicky je aniontoměničová chromatografie (AEX) kombinována s hydrofobní interakční chromatografií (HIC), aby se účinně odstranily nečistoty a obohatila vysoce bioaktivní superspirální plazmidová DNA, čímž se významně zlepší čistota plazmidu.
Po purifikaci se plazmid znovu podrobí TFF, aby se roztok zkoncentroval na cílovou koncentraci (obvykle 0,5–2 mg/ml) a provedla se dialýza s finálním skladovacím pufrem. Tento krok odstraňuje z procesu zbytkové soli a organická rozpouštědla a zajišťuje, že pufrovací systém splňuje požadavky pro následné in vitro transkripční (IVT) reakce.
Purifikace in vitro transkribované (IVT) mRNA
In vitro transkripce (IVT) a modifikace jsou klíčové procesy pro přípravu zásobních roztoků mRNA. Při produkci IVT mRNA se využívá kombinace filtrace s tangenciálním tokem (TFF1) – chromatografie – filtrace s tangenciálním tokem (TFF2). Tato strategie zajišťuje efektivní a vysoce{4}}kvalitní čištění mRNA a poskytuje zásadní podporu pro výrobu vakcín.
Po dokončení transkripčních a modifikačních reakcí se jako první obvykle provádí ultrafiltrace/diafiltrace pomocí membránových kazet nebo kolon s dutými vlákny s mezní molekulovou hmotností- 30 kDa, 100 kDa nebo 300 kDa. Tento krok účinně odstraňuje různé nečistoty související s procesem z reakčního systému, jako je RNA polymeráza, zbytkové fragmenty DNA, nezreagované NTP, uzavírací enzymy, dvou-řetězcová RNA (dsRNA) a inhibitory malých-molekul, přičemž současně dochází k výměně pufru. Po jediném kroku filtrace s tangenciálním tokem je většina nečistot účinně odstraněna a jedinou detekovatelnou reziduální proteinovou nečistotou je RNA polymeráza.
Následně se pro další čištění použije více chromatografických technik. Mezi běžně používané metody patří afinitní chromatografie, velikostní-vylučovací chromatografie, iontová-párová reverzní-fázové chromatografie a iontoměničová-chromatografie. Prostřednictvím této kombinace ultrafiltrace a sekvenční chromatografie dosahuje mRNA vysoké úrovně čistoty.
Pro splnění požadavků na formulaci nebo skladování se zásobní roztok mRNA opět zahustí nebo zředí pomocí 30 kDa, 100 kDa nebo 300 kDa membránových kazet nebo kolon s dutými vlákny, aby se přesně upravila cílová koncentrace a výměna do konečného pufru pro formulaci. Nakonec se použije sterilní filtrace -pro kontrolu mikrobiální zátěže, čímž se dokončí dočasné skladování a plnění materiálu.
Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).
Purifikace mRNA-LNP formulací
Lipidové nanočástice (LNP) jsou v současnosti nejrozsáhleji studovaným aplikačním systémem pro mRNA terapeutika. V současné době jsou různé formulace mRNA-LNP v různých fázích preklinického a klinického vývoje. LNP jsou vysoce citlivé na výrobní procesy. Mezi jednotkovými operacemi potřebnými pro produkci mRNA-LNP představují významné výzvy koncentrace a výměna pufru prostřednictvím filtrace s tangenciálním tokem (TFF) a také sterilní filtrace. Tyto kroky musí být pečlivě optimalizovány, aby byla zajištěna škálovatelnost procesu a kvalita produktu a zároveň se zabránilo problémům, jako je zanášení membrány a nesprávné zatížení filtru.
Po zapouzdření mRNA se k purifikaci použije filtrace s tangenciálním tokem (TFF). Účelem tohoto kroku je odstranit nezapouzdřenou mRNA, volné polymery nebo lipidové materiály, stejně jako zbytková rozpouštědla z mRNA a lipidů. Vzhledem k tomu, že mRNA-LNP vykazují omezenou stabilitu při pokojové teplotě, optimalizace následných procesů, včetně TFF, je rozhodující pro udržení kvality produktu.
Mezi klíčové optimalizační směry patří: vhodné nastavení transmembránového tlaku (TMP) a tangenciálního průtoku na základě velikosti částic a stability mRNA-LNP pro vyvážení účinnosti filtrace a napětí částic; výběr membrán nebo kolon s dutými vlákny s vhodnými limity molekulové hmotnosti (MWCO, např. 100 kDa nebo 300 kDa) pro účinné odstranění volné mRNA, nečistot a výměnného pufru při minimalizaci adsorpce nebo poškození částic; a optimalizaci koncentračních a diafiltračních objemů pro zajištění účinné výměny pufru do cílové formulace a řízení konečné koncentrace a disperzity částic.
Kromě toho musí být během procesu pečlivě sledovány kritické kvalitativní atributy (jako je velikost částic, index polydisperzity [PDI] a účinnost zapouzdření mRNA) a parametry dynamicky upravovány na základě údajů v reálném čase-, aby bylo dosaženo stabilní, škálovatelné a účinné purifikace a formulace mRNA-LNP.
Kromě toho se kvůli nestabilitě mRNA-LNP a jejich složek při metodách terminální sterilizace obvykle používá k odstranění bakterií a jiných mikrobiálních kontaminantů 0,2µm sterilní-filtr.