Proces koncentrace downstream ultrafiltrace/diafiltrace: Jak účinně zabránit pronikání a ztrátě cílového proteinu

Proces koncentrace ultrafiltrace/diafiltrace po proudu: Jak účinně zabránit pronikání a ztrátě cílového proteinu

V následných purifikačních procesech pro rekombinantní proteiny, krevní produkty a další biologické látky se ultrafiltrace/diafiltrace (UF/DF) používá ke koncentraci suroviny, výměně pufru a odstranění solí a malých-molekulových nečistot. Separace je dosažena na základě membránového prosévání: velké molekuly, jako jsou monoklonální protilátky (mAb), jsou zadrženy membránou, zatímco soli, endotoxiny, volné proteiny hostitelských buněk (HCP) a další malé -nečistoty molekul procházejí membránou a jsou odstraněny v permeátu. Během škálování-procesů může snadno dojít k cílové ztrátě proteinu přes membránu, což přímo snižuje výtěžek a zvyšuje náklady na šarže. Za některých provozních podmínek může být protein detekován v permeátu, což vyžaduje rychlé určení, zda uniklé složky jsou intaktní cílová mAb, degradované/fragmentované agregáty nebo proteiny hostitelských buněk. Tento článek je rozdělen do dvou hlavních částí: shrnuje tradiční postupy-kontrolní přístupy a v kombinaci s Design of Experiments (DOE) vytváří robustní procesní okno podporované řadou analytických metod k určení identity proteinů detekovaných v permeátu.

 

 

I. Klíčové příčiny permeace cílového proteinu přes membránu během UF/DF

1. Nadměrný transmembránový tlak (TMP)
Když je tlakový rozdíl přes membránu příliš vysoký, zvýší se odpor rozpouštědla, čímž se do permeátu vtlačí určitý monomerní protein. Během zvyšování-obsahuje napájecí nádrž větší objem materiálu a kolísání tlaku v potrubí je výraznější, takže přechodný přetlak je pravděpodobnější než v laboratorním měřítku.

2. Nesprávný tangenciální průtok
Pokud je průtok příliš nízký, vytvoří se na povrchu membrány hustá koncentrační-polarizační vrstva a místní koncentrace proteinu může překročit práh tolerance membrány. Pokud je průtok příliš vysoký, smykové napětí může způsobit strukturální štěpení mAb, čímž se vytvoří menší proteinové fragmenty, které mohou volně procházet póry membrány.

3. Příliš vysoká koncentrace bílkovin v surovině
Když je koncentrace proteinu v krmivu příliš vysoká, protein se hromadí na povrchu membrány a část monomerního proteinu se může dostat do permeátu. To je běžný problém ve-výrobě ve velkém měřítku.

4. pH nebo vodivost mimo rozsah procesu
Změny v charakteristice náboje proteinu mohou snížit jeho hydratační poloměr a zdánlivou velikost částic, což vede k abnormální permeaci membránou.

5. Stárnutí membránové kazety, vysoký difúzní tok nebo nedostatečná před-kondicionace
Fyzikální defekty v membránové kazetě mohou přímo způsobit únik proteinu a představovat-riziko související se zařízením. Opakovaný CIP se silně alkalickými roztoky může postupně poškodit materiál polyethersulfonové (PES) membrány.

6. Nadměrný objem diafiltrace
Během prodloužené diafiltrace může kontinuální proplachování rozpouštědlem postupně odnášet malá množství monomerního proteinu.

 

II. Tradiční praktická opatření k zabránění pronikání a ztrátě cílového proteinu

(A) Řízení parametrů procesu

1. Kontrola transmembránového tlaku (TMP)
Definujte horní mez varování před tlakem a nastavte alarmy blokování, abyste zabránili přechodným nárazům vysokého tlaku- na membránovou vrstvu. Po určení základních parametrů v malém měřítku snižte bezpečný provozní tlak během-zvýšení výroby a vyhraďte si vhodný rozsah tolerance procesu.

2. Optimalizujte rychlost příčného toku
Vytvořte stabilní hraniční vrstvu a snižte koncentrační polarizaci na povrchu membrány pomocí křížového toku, čímž se minimalizuje akumulace proteinu na povrchu membrány u zdroje.

3. Omezte konečnou koncentraci po koncentraci
Definujte koncentrační limit na základě fyzikálně-chemických vlastností proteinu a vyhněte se nadměrné koncentraci krmiva. U mAb rutinní konečná koncentrace obecně nepřesahuje 50 mg/ml; u některých mAb náchylných k agregaci- by měla být koncentrace dále snížena.

4. Kontrolujte pH a vodivost krmiva
Udržujte stabilní velikost hydratovaných částic proteinu a vyhněte se molekulární kontrakci způsobené kyselými/zásaditými nebo iontovými -poruchy síly.

(B) Zařízení a ovládací prvky

1. Před každou dávkou proveďte test integrity membránové kazety
Před výrobou každé šarže proveďte bublinový-test, abyste identifikovali porušená membránová vlákna. Poškozené membránové kazety by měly být okamžitě zlikvidovány, aby se zabránilo neustálému úniku proteinu.

2. Standardizujte postup čištění CIP
Kontrolujte koncentraci NaOH a dobu kontaktu. Po silně alkalickém čištění zcela ekvilibrujte materiál membrány, abyste snížili riziko deformace pórů membrány.

3. Použijte postupnou diafiltraci
Během rané fáze použijte výměnu velkého objemu pufru, abyste odstranili soli, a zpomalte průtok diafiltrace, jak se blíží koncový bod, abyste snížili odpor a ztrátu proteinu.

 

III. Vytvoření prostoru návrhu procesu prostřednictvím DOE (QbD Process Characterization; použitelné pro IND Submission)

1. Faktorový screening
Prohlédněte si pět klíčových procesních parametrů UF/DF (P): transmembránový tlak, průtok nástřiku, počáteční koncentraci bílkovin, pH nástřiku a provozní teplotu.
Proměnné odezvy: zadržený výtěžek, obsah bílkovin v permeátu, membránový tok a procento agregátů s vysokou -molekulární-hmotností.

Pomocí analýzy významnosti identifikujte klíčové faktory, které přispívají k úniku bílkovin.

2. Modelování povrchu odezvy
Vyberte čtyři parametry s nejvyšší významností pro vytvoření povrchu odezvy a analýzu interakcí mezi parametry. Za mnoha provozních podmínek může jeden parametr zůstat ve svém kvalifikovaném rozsahu, zatímco kombinace dvou parametrů může vést k permeaci proteinu. Takové interakční efekty nelze identifikovat tradičními-faktorovými-experimenty--v určité době. Na základě modelu definujte funkční návrhový prostor. Dokud parametry procesu zůstanou v tomto rozmezí, lze zajistit účinnou retenci proteinů, zatímco nečistoty jsou odstraněny diafiltrací.

3. Nejhorší-výzva případu (vyžaduje se pro charakterizaci procesu)
Chcete-li simulovat výrobní variabilitu, vyberte parametry procesu na extrémech provozních hranic: maximální TMP, minimální rychlost křížového průtoku a horní-mez koncentrace proteinu. Ověřte, že ani za extrémních provozních podmínek nedochází k velkým-ztrátám cílového proteinu, čímž jsou splněny požadavky na kontrolu CMC.

 

IV. Více analytických metod k identifikaci proteinů detekovaných v permeátu a rozlišení cílové mAb, degradačních fragmentů a HCP

Na základě analytické účinnosti, nákladů a regulačních scénářů předložení lze metody rozdělit do dvou kategorií: rychlý screening a konfirmační testování. Pro rutinní monitorování procesu by měly být upřednostněny rychlé metody; pokud se objeví abnormální odchylky, měly by být použity přesné metody identifikace.

1. UV spektrofotometrie (rychlé online screening; preferováno pro rutinní{1}}monitorování podlahy v obchodě)
Seberte permeát a změřte jeho absorbanci A280. To může pouze určit, zda je protein přítomen v permeátu, a nemůže rozlišit druhy proteinu. Používá se především pro rutinní monitorování procesů. Neustále se zvyšující hodnota A280 indikuje zhoršující se únik proteinu a vyžaduje okamžité pozastavení diafiltrace a vyšetření procesu.

2. Elektroforéza SDS-PAGE (nejběžněji používaná metoda kvalitativní identifikace)
Použijte redukční a neredukující -elektroforézu a porovnejte pozice pásem s pozicemi cílové mAb ve výchozím materiálu:
1) Pokud je poloha proužku zcela konzistentní s cílovou mAb, intaktní mAb pronikla membránou.
2) Pokud se objeví pásy s nižší -molekulární- hmotností, protein prošel hydrolytickým štěpením za vzniku fragmentů mAb.
3) Pokud jsou pásy rozptýleny s více různými pásy, většinou jde o proteiny hostitelských buněk (HCP) z hostitelských buněk E. coli/CHO spíše než cílový produkt.

3. Vysoce-výkonná velikost-vylučovací chromatografie (HPSEC)
Oddělte složky podle velikosti molekul a porovnejte jejich eluční časy s časy chromatogramu suroviny:
- Hlavní pík se stejným retenčním časem jako mAb označuje intaktní cílový protein.
- Pík eluující dříve označuje agregáty/fragmenty s vysokou-molekulární-hmotností.
- Pík eluující později označuje fragmenty degradace s nízkou -molekulární- hmotností.
- Absence charakteristického hlavního píku ukazuje na proteiny nečistot HCP.
Tato metoda může poskytnout kvantitativní data a může být zahrnuta do zpráv o vyšetřování odchylek procesu; má vysokou akceptaci v klinických předkládaných materiálech.

4. Testování soupravy ELISA na protein hostitelské buňky HCP{1}}
Pokud je v permeátu detekován protein, výsledek testu ELISA je zvýšený a HPSEC nevykazuje žádný charakteristický pík mAb, lze v zásadě určit, že uniklý materiál jsou proteiny hostitelských-buněk CHO. To ukazuje na neúplné odstranění nečistot během předřazeného čištění; nečistoty se vymývají během fáze UF/DF a nepředstavují ztrátu produktu.

5. Ověření afinitní chromatografií (Protein A chromatografie)
Protein A specificky váže Fc oblast mAb. Naneste vzorek permeátu na kolonu: výskyt charakteristického elučního píku indikuje přítomnost intaktní cílové protilátky; nepřítomnost elučního píku ukazuje, že všechny proteiny v permeátu jsou proteiny nečistot.

6. Hmotnostní spektrometrie (LC-MS) (v-hloubkové návaznosti; používá se pro zkoumání velkých odchylek procesu)
LC-MS může přímo analyzovat sekvenci aminokyselin a přesně určit původ proteinu. Používá se hlavně pro vyšetřování obtížných nebo neobvyklých odchylek a nepoužívá se jako rutinní-test kontroly procesu.

V. Nápravná opatření odpovídající různým analytickým výsledkům

1. Intaktní cílová mAb detekovaná v permeátu
Snižte transmembránový tlak a konečnou koncentraci po koncentraci; zúžit provozní rozsah procesu na základě výsledků DOE; a zkontrolujte integritu membránové kazety.

2. Fragmenty degradace protilátky detekované v permeátu
Prozkoumejte smykové napětí během procesu a extrémy pH; optimalizovat krok inaktivace viru upstream ke snížení štěpení proteinu.

3. V permeátu detekovány pouze proteiny nečistot HCP
Není potřeba žádná úprava parametrů UF/DF. Vysledujte problém zpět k předchozím krokům chromatografie a zlepšete odstraňování nečistot během afinitní a iontoměničové -chromatografie.

 

VI. Shrnutí

Aby se předešlo úniku proteinu během UF/DF, tradiční procesní řízení se při definování jednotlivých bodových parametrů spoléhá na historické zkušenosti, které mohou adekvátně řešit pouze stabilní malo-výrobu. Chcete-li zajistit stabilní výkon během postupného škálování-procesů, měla by být k vytvoření prostoru návrhu procesu s dostatečnou tolerancí použita charakterizace procesů založená na DOE{3}}. Intervalové-řízení parametrů může kompenzovat výrobní variabilitu. Jakmile je protein detekován v permeátu, jednoduchý UV detekční systém může poskytnout počáteční varování, po kterém následuje elektroforéza, HPSEC a ELISA pro sledovatelnost a identifikaci. To umožňuje přesné rozlišení mezi cílovým produktem a nečistotami hostitelských-buněk, což umožňuje cílené vyšetřování kořenové-příčiny a nápravná opatření. Toto je také standardizovaná výzkumná složka, která je v současnosti součástí dokumentace CMC pro projekty mAb.