Aplikace ultrafiltrace při extrakci přírodního kolagenu

Kolagen jako přírodní zdroj bílkovin má dobrou biokompatibilitu, nízkou antigenicitu, biologickou odbouratelnost a hemostázu, svou těsnou helikální strukturu a vlastní vlastnosti, to vše poskytuje předpoklady pro jeho industrializaci. Kolagen a jeho vedlejší produkty se používají nejen jako obalové materiály, kosmetika a zdravotnické produkty, ale také jako potravinářské přídatné látky ke zkvalitnění masného výrobku a hraje důležitou roli zejména v lékařské oblasti.

 

Co je kolagen?

 

Kolagen je biologická makromolekula, hlavní složka pojivové tkáně zvířat a nejhojnější a nejrozšířenější funkční protein u savců, který tvoří 25 % až 30 % celkového proteinu a v některých organismech dokonce až 80 % nebo více. Hraje roli vazebné tkáně v živočišných buňkách.

Měří se, že tělo dospělého má asi 3 kg kolagenu, který se nachází hlavně v lidské kůži, kostech, očích, zubech, šlachách, vnitřních orgánech (včetně srdce, žaludku, střev, krevních cév) a dalších částech lidského těla. funkcí je udržovat morfologii a strukturu kůže a tkání a orgánů a je také důležitou surovinou pro opravy různých tkání po poranění.

 

Existuje mnoho typů kolagenového proteinu a běžné typy jsou typ I, typ II, typ III, typ V a XI. Díky své dobré biokompatibilitě, biologické rozložitelnosti a biologické aktivitě je kolagen široce používán v potravinářství, medicíně, tkáňovém inženýrství, kosmetice a dalších oborech.

Jak extrahovat přírodní kolagen

Živočišné tkáně z hospodářských zvířat a drůbeže jsou hlavním způsobem, jak lidé získávají přírodní kolagen a jeho kolagenní peptidy. Kvůli souvisejícím chorobám zvířat a určitým náboženským přesvědčením je však používání kolagenu a jeho produktů ze suchozemských savců lidmi omezené a vývoj se postupně obrací k mořským organismům. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) potvrdil, že ani kolagen získaný ze zvířecích kostí nemá potenciál infikovat nemoc šílených krav a další související nemoci. Vzhledem k rozdílům ve složení aminokyselin a stupni zesítění mají vodní živočichové, zejména kolagen bohatý na odpady z jejich zpracování, jako je kůže, kosti a šupiny, mnoho výhod, které kolagen pro hospodářská zvířata nemá. Kromě toho je kolagen získaný z mořských zvířat zjevně lepší než kolagen ze suchozemských zvířat v některých aspektech, jako je nízká antigenicita a hypoalergenita. Proto může vodní kolagen postupně nahradit kolagen suchozemských zvířat. Jako příklad byl vzat proces extrakce kolagenu ze šupin amurů.

 

Extrakce kolagenu ze šupin amurů metodou ultrafiltrace

1. Materiály a metody

1.1 Zkušební vzorek

Vodný extrakt surového kolagenu.

1.2 Zkušební metody

1.2.1 Proces ultrafiltrace

 

1.2.2 Stanovení procesu předfiltrace

V tomto testu se porovnává a analyzuje metoda vakuové filtrace a metoda mikrofiltrace, aby se určil nejlepší proces předfiltrační filtrace. Konkrétní zkušební metody jsou následující:

① Surový kolagenový vodní extrakt byl filtrován vakuovým čerpáním filtračního papíru, aby se odstranily suspendované částice a nečistoty ve vodním extraktu.

② Surový kolagenový vodný extrakt byl filtrován 0,2μm mikrofiltrační membránou, aby se odstranil nerozpustný materiál a nečistoty ve vodném extraktu.

 

1.2.3 Výběr velikosti pórů ultrafiltrační membrány

Velikost pórů ultrafiltrační membrány byla 100 kDa.

 

1.2.4 Jednofaktorový experiment procesu čištění ultrafiltrací

K čištění surového kolagenového vodního extraktu byla použita ultrafiltrační technologie a byly studovány jednofaktorové experimenty vlivu provozního tlaku, provozní teploty a hodnoty pH na retenci kolagenu. Poté, co bylo ultrafiltrační zařízení po určitou dobu spuštěno a stabilizováno, byl studován vliv různých faktorů na retenci kolagenu.

 

1.2.5 Výpočtový vzorec

 

2. Výsledky a analýza

2.1 Výsledky analýzy předfiltračního procesu

Výsledky srovnání dvou filtračních metod vakuové extrakce a mikrofiltrace jsou uvedeny v následující tabulce.

 

Z tabulky je vidět, že jak metoda vakuové filtrace, tak metoda mikrofiltrace mohou odstranit nečistoty a nerozpustné pevné látky v roztoku, ale metoda mikrofiltrace má lepší ochranný účinek na proteiny, to znamená, že ztráta není zřejmá a metoda vakuové filtrace je snadno způsobit ztrátu bílkovin. Kromě toho se u metody vakuové filtrace objeví zákal poté, co je filtrát umístěn na určitou dobu, a mikrofiltrát je stále čirý a průhledný, takže mikrofiltrace je zvolena jako předúprava ultrafiltrace.

 

2.2 Jednofaktorový test procesu ultrafiltrace

2.2.1 Vliv ultrafiltračního tlaku na retenční rychlost

Za podmínky teploty 40 stupně a pH=9.0, vliv různých ultrafiltračních tlaků (0.07MPa, {{9} }.0Byla studována retence proteinů 9MPa, 0,11MPa, 0,13MPa a 0,15MPa). Výsledky jsou uvedeny na obrázku níže.

Jak je vidět z obrázku výše, se zvyšováním provozního tlaku se rychlost retence proteinu postupně snižuje. Když je provozní tlak {{0}}.07MPa, je míra zadržení bílkovin 96,53 %, a když je provozní tlak 0,15 MPa, míra zadržení bílkovin je 84,38 %. Je to proto, že separační účinek ultrafiltrace na látky se provádí tlakovým rozdílem. V oblasti nízkého provozního tlaku mohou malé molekuly rychle procházet membránou, zatímco velké molekuly mohou být zachyceny ultrafiltrační membránou a hromadí se na povrchu membrány. V tomto okamžiku tvoří povrch membrány a vodní extrakt koncentrační rozdíl, což má za následek odpor proti polarizaci koncentrace. V tomto okamžiku je tlak relativně nízký a nemůže mít velký vliv na míru zadržování. S rostoucím tlakem se však postupně zvyšuje koncentrační polarizační odpor a koncentrační rozdíl mezi povrchem membrány a vodním extraktem se dostává do rovnováhy. Když tlak překročí tuto rovnováhu, může se na povrchu membrány vytvořit gelová vrstva (což je v souladu s teorií, že koncentrační polarizace a kondenzační vrstva se tvoří během ultrafiltrace), a tlak se stále zvyšuje, tloušťka gelové vrstvy se zvyšuje a protein zbývající na povrchu membrány se také zvyšuje. To má za následek nižší míru retence. Pro zajištění separačního účinku membrány je optimální parametr provozního tlaku 0,07 MPa.

 

2.2.2 Vliv teploty na retenci bílkovin

Za podmínek {{0}}.11MPa tlaku a pH=9.0, účinky různých teplot, konkrétně 25 stupňů , 30 stupňů , 35 stupňů , 40 stupňů a 45 stupňů , na bílkoviny byly studovány retence. Výsledky jsou uvedeny na obrázku níže.

Jak je vidět z obrázku výše, míra retence ultrafiltrační membrány se postupně zvyšuje se zvyšováním teploty a dosahuje maxima při 45 stupních s mírou retence 97,01 %. Viskozita kolagenu totiž úzce souvisí s teplotou. Když je teplota nízká, viskozita kolagenu je větší a akumulace kolagenu na povrchu membrány snadno vytváří odpor, což má za následek nízkou míru zadržování. Při zvýšení teploty klesá viskozita kolagenu, oslabuje se interakce mezi molekulami kolagenu a zvyšuje se rychlost přenosu hmoty, zeslabuje se jev koncentrační polarizace a zvyšuje se retenční rychlost. Dalším důvodem pro zvýšení retenční rychlosti je, že se zvyšuje teplota, odpovídajícím způsobem se zvyšuje i rozpustnost kolagenu a snižuje se fenomén blokování membrány kolagenem, takže optimální teplota ultrafiltrace je 45 stupňů.

 

2.2.3 Vliv hodnoty pH na retenci bílkovin

Za podmínek {{0}}.11MPa tlaku a 40 stupňů teploty vliv různých podmínek pH, konkrétně pH=6.0, pH{{ 5}}.{{10}}, pH=8.0, pH=9.0 a pH=10.0, byla studována míra retence. Výsledky jsou uvedeny na obrázku níže.

 

As can be seen from the figure above, in the range of pH 6-7, the protein retention rate decreases with the increase of pH value, and the minimum value is 82.13% when pH=7.0; when pH>7, the retention rate gradually increases with the increase of pH value. This is because the isoelectric point of collagen is pH=7. At the isoelectric point, the protein is in a state of precipitation, which is easy to stay on the surface of the membrane and block the membrane, thus reducing the retention rate. When pH>7, míra retence se postupně zvyšuje se zvyšováním hodnoty pH. Je to proto, že ultrafiltrační membrána je polyetherová javorová membrána se záporným nábojem a kolagen je záporně nabitý za alkalických podmínek. Záporně nabité molekuly kolagenu tvoří vzájemně se vylučující stav s ultrafiltrační membránou se stejným nábojem, takže molekulám kolagenu není snadné zůstat na povrchu membrány a membránu blokovat. Proto je optimální hodnota pH ultrafiltrace 8-10.

 

2.3 Optimalizace procesu ultrafiltrace a ověření výsledků

Podle analýzy softwaru Design-Expert8.05 jsou optimální parametry procesu: provozní tlak 0.14MPa, provozní teplota 40.98 stupňů, pH roztoku{{7 }}.43 a míra zachování je 92,551 %. S ohledem na provozuschopnost skutečných parametrů byly zvoleny podmínky ultrafiltrace jako provozní tlak 0,14 MPa, provozní teplota 40 stupňů a hodnota pH materiálového roztoku 9,50 a ověření testu bylo zahájeno po spuštění a stabilizaci ultrafiltračního systému. Výsledek míry retence byl (92,61±0,1) % (n=3). Předpovězené hodnoty rovnice jsou v zásadě podobné naměřeným hodnotám, což ukazuje, že výsledky předpokládaných parametrů podmínek jsou v souladu s výsledky skutečných podmínek.

 

2.4 Výsledky elektroforetické analýzy

Purifikovaný kolagen byl analyzován elektroforézou SDS-PAGE a výsledky jsou uvedeny na následujícím obrázku.

 

Jak je vidět z obrázku výše, dráha 1 je purifikovaný kolagen tohoto testu a dráha 2 je standardní vzorek kolagenu z lýtkové šlachy. Z elektroforézy SDS-PAGE lze vidět, že kolagen v této studii lze identifikovat jako kolagen, ale zdá se, že hranice mezi a1 peptidovým řetězcem a a2 peptidovým řetězcem nejsou jasné. Z elektroforetické mapy je vidět, že zde není žádná jiná proteinová nečistota, takže lze usoudit, že purifikovaný kolagen je vysoce čistý.

O Guidlingu

 

Guidling Technology je národní high-tech podnik se zaměřením na biofarmaceutika, buněčné kultury, čištění a koncentraci biomedicíny, diagnostiky a průmyslových tekutin. Úspěšně jsme vyvinuli odstředivá filtrační zařízení, ultrafiltrační a mikrofiltrační kazety, virový filtr, TFF systém, hloubkový filtr, dutá vlákna atd., která plně splňují aplikační scénáře biofarmaceutik, buněčných kultur a tak dále. Naše membrány a membránové filtry jsou široce používány při zahušťování, extrakci a separaci předfiltrace, mikrofiltrace, ultrafiltrace a nanofiltrace. Naše mnoho produktových řad, od malých laboratorních filtrací na jedno použití až po produkční filtrační systémy, testování sterility, fermentace, buněčné kultury a další, splňuje potřeby testování a výroby. Guidling Technology se těší na spolupráci s vámi!