Technologie inaktivace a odstranění virů z krevních produktů

Krevní produkty jsou „složky plazmatických proteinů nebo složky krevních buněk, jako je lidský krevní albumin, lidský imunoglobulin, koncentrát červených krvinek s lidským koagulačním faktorem (přírodní nebo rekombinantní) atd., oddělené od zdravé lidské plazmy nebo specificky imunitní lidské plazmy, purifikované popř. vyrobené technologií rekombinantní DNA pro diagnostiku, terapii nebo pasivní imunoprofylaxi“. Krevní produkty hrají důležitou roli v lékařské pohotovosti, záchraně válečných zranění a v prevenci a léčbě některých specifických nemocí.

 

Regulační pozadí

Postupy pro zajištění bezpečnosti musí zajistit, že konečný lék je bezpečný pro regulační orgány a v konečném důsledku pro pacienty a veřejnost. Mezinárodní koordinační konference (ICH 1998) vydala v 90. letech 20. století „Q5A: Hodnocení virové bezpečnosti biotechnologických produktů buněčných linií lidského nebo zvířecího původu“ (Q5A: Hodnocení virové bezpečnosti), čímž se stanovil celosvětový standard pro virovou bezpečnost.

ICH Q5A popisuje vícevrstvé schéma pro testování a validaci clearingu k dosažení tohoto cíle. Testovací program se zaměřuje na buněčnou banku, sklizeň surovin a bioreaktoru, doplněný analýzou rizik produktu. Kromě testování vyžaduje ICH Q5A, aby byla následná dekontaminace vyhodnocena jako opatření bezpečné při poruše, když proti proudu nejsou detekovány žádné kontaminanty. Ověření clearance zajišťuje, že pokud se jakýkoli virus vyhýbá testovacímu režimu, může být odstraněn a/nebo inaktivován dříve, než skončí v konečném léku.

 

Pozadí k celkovému antivirovému bezpečnostnímu programu

V moderní biotechnologické výrobě (nebo biozpracování) jsou obvykle tři nebo čtyři jednotkové operace v celé purifikované sekvenci schopné odstranit nebo inaktivovat virus. To zahrnuje určité chromatografické kroky (jako je protein A nebo aniontová výměna), kultivaci s nízkým pH nebo detergenty a filtry pro zadržení virů. Ne všechny tyto kroky účinně odstraní nebo inaktivují všechny viry.

Například kultura s nízkým pH je obvykle neúčinná pro inaktivaci neobaleného viru, ale funguje dobře pro inaktivaci obaleného viru. Za určitých provozních podmínek nemusí být aniontová výměnná kolona schopna vázat a odstraňovat neutrální izoelektrické viry z proudu produktu, ale je účinná proti kyselým virům.

Jedná se o kombinaci tří až čtyř nezávislých a ortogonálních jednotkových operací, které společně zajišťují virovou bezpečnost biotechnologických produktů.

 

Obecně se předpokládá, že robustní, efektivní a spolehlivý krok zpracování bude schopen odstranit nebo inaktivovat velký počet virů (typicky definovaných jako 4 log10 nebo větší, kde hodnota log snížení nebo LRV se vypočítá jako log10 z celkového počtu počet virů na vstupu dělený celkovým počtem virů na výstupu). LRV však nelze použít jako jediné absolutní měřítko účinnosti kroku. Údaje mohou být předběžné. Je snadné jej modelovat, je relativně necitlivý na změny podmínek procesu a účinný proti řadě virů (WHO 2004).

Virová filtrace je široce uznávána jako silný a účinný procesní krok a je klíčovou složkou celkové strategie minimalizace rizika exogenních a endogenních virových částic během výroby biotechnologických produktů.

Virové filtry často fungují prostřednictvím silných retenčních mechanismů založených na velikosti. Na základě tohoto silného mechanismu účinku je pravděpodobnější, že virové filtry než chromatografické kroky poskytují předvídatelnou virovou retenci pro řadu virů. Je to proto, že je méně pravděpodobné, že bude filtr ovlivněn rozdíly ve fyzikálně-chemických vlastnostech různých virů a interakcemi virus-pryskyřice regulovanými provozními podmínkami. Proto se krok virové filtrace běžně používá v dobře navržených procesech čištění rekombinantních terapeutických proteinů (EMEA 1996), u kterých se také ukázalo, že mají robustní výkon v průmyslu zpracování plazmy.

 

Krevní produkty jsou však jako dvousečná zbraň, která nejen zachraňuje tisíce životů, ale má také možnost šířit nemoci a ohrožovat lidské zdraví. Podle statistik v letech 1977 až 1984 nejméně 30000 příjemců krve ve Spojených státech dostalo krev infikovanou virem AIDS. V roce 1985 bylo 1200 ze 3000 hemofiliků ve Francii infikováno AIDS prostřednictvím krevních transfuzí nebo krevních produktů.

Podle Světové zdravotnické organizace je celosvětově 5 až 10 % infekcí AIDS způsobeno transfuzemi krve nebo krevních produktů infikovaných AIDS. První případ AIDS v Číně byl infikován použitím dovezených krevních produktů infikovaných virem AIDS. Kromě toho byl také hlášen přenos onemocnění hepatitidy B a C v důsledku transfuze krve a krevních produktů.

 

1. Hlavní viry přenášené krevními produkty a jejich charakteristika

Existuje mnoho typů virů, které se přenášejí krví a krevními produkty, jak ukazuje tabulka 1. Mezi nimi jsou HIV, HBV a HCV znepokojeny domácími i zahraničními lékařskými kruhy kvůli jejich vysoké míře infekce a vážnému poškození.

Protože krev a krevní produkty mají možnost šíření virů, vážně ovlivnila její uplatnění v prevenci a léčbě nemocí. Proto je třeba při výrobě krevních produktů přidat procesy inaktivace a odstranění virů, aby byla zajištěna bezpečnost krevních produktů.

2. Hlavní metody inaktivace a odstranění viru

Aby byla zajištěna bezpečnost krevních produktů, kromě výběru dárců krve, imunizace tam, kde je to možné, a přísného testování odebrané krve a dalších opatření, je důležitým článkem k zajištění inaktivace a odstranění virového ošetření krevních produktů. bezpečnost krevní transfuze. Níže je podrobně popsáno několik běžně používaných a účinných metod pro inaktivaci a odstranění virů.

 

I. Metody inaktivace virů

1. Pasteurova metoda

Teoretickým základem této metody je, že míra destrukce virové struktury je mnohem vyšší než destrukce proteinové struktury prostřednictvím volby teploty a doby působení. Téměř 50 let výsledků klinického používání a nedávných pokusů na zvířatech potvrdilo, že albumin v roztoku po 60 stupních, 10 hodinách tepelného ošetření, tedy Pasteurově dezinfekci, může nejen inaktivovat HBV, ale také inaktivovat HCV a HIV, takže albumin je nejspolehlivější krevní produkt ve virové bezpečnosti.

V poslední době byl Pasteurův proces rozšířen na výrobu IVIG, FVI, FIX, fibrinogenu a dalších produktů. Bridonnccu a kol. přidal tento proces inaktivace viru k procesu IVIG výroby etanolu při nízké teplotě, to znamená, že Pasteurova metoda byla implementována za podmínek bez stabilizátoru, nízké soli a kyselosti a titr viru se snížil o 5 log. Simmonds a kol. testovali transfuzí přenášený virus (TTV) koncentrovaných přípravků FVⅢ a FIX klinicky používaných ve Spojeném království a zjistili, že míra detekce TTV u produktů bez inaktivace Pasteurova viru byla 50 % až 75 % a míra pozitivní detekce produktů po Pasteurově inaktivaci bylo 0.

Pozitivní míra TTV byla 27 % u 84 pacientů s hemofilií ve Spojeném království, kteří používali přípravky s neinaktivovaným koagulačním faktorem, zatímco pouze 1 z 19 pacientů užívajících přípravky s virem inaktivovaným koagulačním faktorem byl pozitivní, s mírou pozitivní detekce 5 %. Proto je proces inaktivace viru velmi účinný při zlepšování bezpečnosti krevních produktů.

 

2. Organické rozpouštědlo kombinované s povrchově aktivní látkou (metoda S/D)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90 %. Velké množství krevních produktů inaktivovaných metodou S/D bylo prokázáno jako bezpečné a spolehlivé díky dlouhodobé klinické aplikaci, takže jsou široce používány. Tato metoda však nemá žádnou inaktivační schopnost proti parvoviru B19, HEV a dalším virům bez liposukce.

 

3. Metoda inaktivace suchým teplem

Inaktivace suchým teplem znamená, že se lyofilizovaný přípravek ošetří zahřátím a virus se usmrtí suchým teplem. Běžně používané metody suchého tepla jsou 60 stupňů ~80 stupňů, metoda ohřevu 10~72 hodin a metoda úpravy 80 stupňů, 72 hodin. Již na počátku 80. let bylo užitečné zahřívat lyofilizovaný koncentrovaný přípravek FVIII a protrombinový komplex na 60 °C ~ 80 °C po dobu 10-72 hodin. Bylo však prokázáno, že tato metoda nemůže zcela inaktivovat HBV, HCV, HIV. Suché tepelné ošetření při 80 stupních a 72 hodinách bylo prokázáno jako účinné při inaktivaci HBV, HCV a HIV. Nedávno se také objevily zprávy o lyofilizovaných přípravcích koagulačních faktorů léčených při 100 stupních. Xu Jinbo et al ošetřili IgG při 100 stupních po dobu 30 minut a inaktivovali virus vezikulární stomatitidy 8,2 Log. Někteří lidé budou mrazem vysušený FVIII při 68 stupních po dobu 72 hodin, v suchém stavu a poté zahřátý na 100 stupňů po dobu 0,5 až 1 hodiny. Tato metoda je poměrně ekonomická.

 

4. Fotochemická metoda

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Log buněk navázaných na HIV a krevní destičky zůstaly dobré po 7 dnech funkční konzervace in vitro, což bylo schváleno FDA pro klinické studie.

Mezi těmito metodami jsou Pasteurova dezinfekční metoda a metoda S/D schváleny americkou FDA a jsou široce používány ve světě. Metoda inaktivace suchým teplem je vhodná především pro inaktivaci virů lyofilizovaných přípravků. Fotochemická metoda má silný inaktivační účinek na viry potažené lipidem a byla použita při inaktivaci virů v celé plazmě v Evropě a má široké vyhlídky na inaktivaci virů ve složkách krevních buněk. Všechny tyto metody však mají své nedostatky, např. Pasteurova sterilizace není ideální pro inaktivaci některých tepelně odolných virů; Metoda S/D nemohla účinně inaktivovat virus nepotažený lipom. Fotochemická metoda významně poškodila aktivitu některých plazmatických proteinů. Současné klinické využití následných výzkumů ukazuje, že žádná metoda inaktivace virů nemůže zaručit, že krevní produkty jsou absolutně bez rizika přenosu virů.

 

I. Proces odstraňování virů

Při výrobě krevních produktů nemůže jeden inaktivační proces inaktivovat všechny viry; Kromě toho je virus sám o sobě heterologní protein, jako vstup s produktem vyvolá nežádoucí reakce; Současně, kvůli omezení technické úrovně, stále existují viry, jejichž vlastnosti nejsou nalezeny nebo pochopeny, takže stávající metody inaktivace virů nemohou zaručit inaktivační účinek těchto virů. Proto samotná inaktivace nemůže zaručit bezpečnost produktu a musí být z produktu odstraněna. Technologie odstraňování virů tedy získává stále více pozornosti. Níže jsou stručně popsány dva běžně používané a účinné procesy odstraňování virů.

1. Chromatografická technologie

Chromatografická technologie se týká použití různých složek a afinity nebo interakčních rozdílů ve stacionární fázi, aby se dosáhlo oddělení různých složek. Jako pokročilá technologie výroby krevních produktů má samotná chromatografie účinek na odstraňování virů, zejména afinitní chromatografie a iontoměničová chromatografie. Pro iontoměničovou chromatografii má eluce při odstraňování virů výhody oproti penetraci. Tabulka 2 ukazuje statistiku dat rychlosti odstraňování HAV pomocí chromatografické technologie v procesu produkce albuminu společností CSL Company v Austrálii. Jak je vidět z tabulky 2, iontoměničová chromatografie a gelová filtrace jsou účinnější při odstraňování HAV, s celkovou rychlostí odstraňování 10,9 log.

Při výrobě FVIII společnost Baxter Healtheare provádí imunoafinitní chromatografii pomocí gelů ošetřených protilátkou anti-FVIII, které mohou odstranit (4,2±0.1)Log a (5,3±0.9)Log z jiných - lipidem potažené viry, jako je PPV a HAV, v daném pořadí.

 

2. Filtrace nanofilmem

U některých virů s malým průměrem povrchu, jako je HAV a parvovirus B19, je nejúčinnější metodou odstraňování nanomembránová filtrace. K izolaci virů využívá rozdílu velikosti mezi proteiny a viry a adsorpce virů filtrační membránou. Laboratorní studie byla provedena v Sanquin Blood Supply Site v Nizozemí na odstranění virů přidáním jednostupňové, dvoustupňové nanomembránové filtrace Planova 15N do procesu výroby protrombinového komplexu. Bylo zjištěno, že rychlosti odstraňování HIV, HAV a dalších virů se po nanomembránové filtraci zvýšily v různé míře (viz tabulka 3).

Při použití této metody v průmyslové výrobě se však mohou vyskytnout následující problémy: Za prvé, kvůli vysoké viskozitě produktu a přítomnosti proteinů s velkým průměrem by velikost pórů membrány zvolená filtrem neměla být příliš malá. čímž se omezí odstraňování virů s malým průměrem, jako je HCV; Za druhé, stabilita kontroly velikosti pórů membrány v procesu výroby filtru ovlivní odstranění viru. Za třetí, když je membránový otvor menší než průměr virové částice zablokován, sníží se průtok produktu, což ovlivní výtěžek. Proto je výběr membrán, jejichž vlastnosti a velikost pórů jsou vhodné pro potřeby zpracovávaných produktů, důležitým faktorem pro to, zda nanomembránová filtrace dokáže viry odstranit.

 

3. Diskuse

Za předpokladu zajištění kvality zdroje krve je proces inaktivace a odstranění viru důležitým a nezbytným prostředkem k zajištění bezpečnosti krevních produktů. Použití pouze jednoho procesu inaktivovaného viru nemůže absolutně zaručit bezpečnost krevních produktů. Na základě technologie inaktivace virů byla přidána technologie odstraňování virů, jako je chromatografie a filtrace nanofilmem, výrazně se zvýšila rychlost odstraňování virů a výrazně se zlepšil účinek inaktivace a odstraňování virů. V současnosti Evropa jasně navrhla, že v procesu výroby krevních produktů musí být pro zajištění bezpečnosti krevních produktů použita alespoň jedna inaktivace a odstranění virů.

V Číně většina výrobců krevních produktů používá ve výrobním procesu pouze jeden proces inaktivovaného viru, jako je Pasteurova dezinfekční metoda, S/D metoda atd., ale nepoužívá proces odstraňování virů, který vážně ovlivňuje kvalitu krevních produktů. Vstupem Číny do WTO bude výrobní proces a standardy kvality domácích krevních produktů v souladu se světem, jinak nemůže zaručit stávající podíl na domácím trhu, ale také nemůže konkurovat podobným produktům v jiných zemích mezinárodní trh.

Proto musí čínští výrobci krevních produktů zlepšit výrobní proces, posílit inaktivaci a odstranění viru, aby byla plně zajištěna kvalita a bezpečnost produktu. Proto bude trendem čínských výrobců krevních produktů používat chromatografii k čištění krevních produktů a odstraňování virů, aby byla zajištěna bezpečnost krevních produktů.

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology je národní high-tech podnik se zaměřením na biofarmaceutika, buněčné kultury, čištění a koncentraci biomedicíny, diagnostiky a průmyslových tekutin. Úspěšně jsme vyvinuli odstředivá filtrační zařízení, ultrafiltrační a mikrofiltrační kazety, virový filtr, TFF systém, hloubkový filtr, dutá vlákna atd., která plně splňují aplikační scénáře biofarmaceutik, buněčných kultur a tak dále. Naše membrány a membránové filtry jsou široce používány při zahušťování, extrakci a separaci předfiltrace, mikrofiltrace, ultrafiltrace a nanofiltrace. Naše mnoho produktových řad, od malých laboratorních filtrací na jedno použití po produkční filtrační systémy, testování sterility, fermentace, buněčné kultury a další, splňuje potřeby testování a výroby. Guidling Technology se těší na spolupráci s vámi!